Tạo dòng kháng nguyên Flic của Edwardsiella ictaluri khảm trong tiêm mao của Bacillus subtilis
Nghiên cứu Y học
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019
TẠO DÒNG KHÁNG NGUYÊN FLIC CỦA EDWARDSIELLA ICTALURI
KHẢM TRONG TIÊM MAO CỦA BACILLUS SUBTILIS
*
*
*
*
Huꢀnh Xuân Yến , Nguyễn Anh Minh , Trần Cát Đông , Vũ Thanh Thảo
TÓMTẮT
Mở đầu: Những năm gần đây, bệnh gan thận mủ gây ra bởi vi khuẩn Edwardsiella ictaluri đã gây
nhiều tổn thất nghiêm trọng về kinh tế cho các hộ nuôi cá tra ở vùng Đồng bằng sông Cửu Long. Phòng
ngừa bệnh bằng vaccin là một lựa chọn tốt hơn so với điều trị bằng kháng sinh. Protein fliC của E. ictaluri
được quan tâm như một kháng nguyên tiềm năng. Đồng thꢀi, Bacillus subtilis là một ứng viên trong việc
làm giá mang kháng nguyên thế hệ mới.
Mục tiêu: Tạo dòng B. subtilis mang protein fliC của E. ictaluri khảm trong tiêm mao hướng đến ứng
dụng làm vaccin phòng bệnh gan thận mủ ở cá tra.
Phương pháp: Trình tự mang tính kháng nguyên fliC được biểu hiện bởi chủng Escherichia coli
BL21(DE3) để làm vaccin subunit đối chứng. Đồng thꢀi, trình tự này cũng được sử dụng để tạo dòng B.
subtilis mang protein kháng nguyên fliC khảm trong tiêm mao. Các chủng B. subtilis tái tổ hợp được kiểm
tra về khả năng di động và biểu hiện tiêm mao.
Kết quả: Protein kháng nguyên fliC với kích thước khoảng 11 kDa được biểu hiện thành công nhꢀ
chủng E. coli BL21(DE3). Nghiên cứu cũng tạo dòng thành công chủng B. subtilis mang kháng nguyên
fliC khảm trong tiêm mao. Chủng B. subtilis này có khả năng di động và biểu hiện tiêm mao.
Kết luận: Chủng B. subtilis tái tổ hợp thu được thể hiện nhiều tiềm năng để phát triển thành một
vaccin đưꢀng uống có khả năng sử dụng như một chế phẩm probiotic.
Từ khóa: Edwardsiella ictaluri, vaccin đưꢀng uống, protein fliC, protein hag.
ABSTRACT
CLONING OF MOSAIC FLIC ANTIGEN OF EDWARDSIELLA ICTALURI
IN BACILLUS SUBTILIS FLAGELLA
Huynh Xuan Yen, Nguyen Anh Minh, Tran Cat Dong, Vu Thanh Thao
* Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 - No 2- 2019: 24 – 31
Background : Recently, catfish farming in the Mekong Delta of Vietnam has been challenging with a
disease named “Enteric septicemia of catfish” (ESC). ESC is a highly fatal systemic infection caused by the
baterium Edwardsiella ictaluri. Vaccination is a better option than treatment. Protein fliC of E. ictaluri has
been considered as a potential antigen. Moreover, Bacillus subtilis presents to be a new generation
recombinant protein carrier.
Method: The predicted antigenic region of fliC is expressed by Escherichia coli BL21(DE3) to serve as
control subunit vaccine. Moreover, this antigenic region is also used to clone B. subtilis with mosaic fliC
antigen in its flagella. The recombinant strain is tested for its motility and capability to express its flagella.
Result: The antigenic region of fliC is successfully expressed by E. coli BL21(DE3) and is detected at the
11 kDa band on SDS-PAGE 18%. The research also succeeds in cloning a B. subtilis strain with mosaic fliC
antigen in its flagella. The results show that this B. subtilis strain is motile and able to express its flagella.
*Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: TS. Vũ Thanh Thảo ĐT: 02838295641 – 127
Email: [email protected].vn
24
Chuyên Đề Dược
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019
Nghiên cứu Y học
Conclusion: The recombinant B. subtilis strain is expected to use as an oral vaccine which can be easily
used as a daily probiotics product.
Key words: Edwardsiella ictaluri, oral vaccine, protein fliC, protein hag
tốn kém về nhân lực còn phương pháp ngâm
MỞĐẦU
trong huyền phù chỉ ứng dụng được trên một
Bệnh gan thận mủ do vi khuẩn
số chủng vi sinh vật gây bệnh đơn giản
.
Edwardsiella ictaluri gây ra trên cá da trơn,
đặc biệt là cá tra thưꢀng xảy ra vào cuối
xuân, đầu hạ, phát triển nhanh chóng, lây
lan mạnh và có tꢁ lệ chết cao gây thiệt hại
nghiêm trọng cho các hộ nuôi cá tra ở Đồng
bằng sông Cửu Long . Cơ chế lây lan của
bệnh là thông qua đưꢀng miệng, cá bệnh sꢂ
phát tán vi khuẩn ra môi trưꢀng qua phân
Chủng ngừa bằng đưꢀng uống trước đây ít
được quan tâm vì các nhược điểm như: kháng
nguyên hòa tan tạo ra phản ứng miễn dịch
kém, có thể bị phân hủy trong dạ dày, hấp thu
và dung nạp hạn chế. Để khắc phục các nhược
điểm này, vaccin uống được gắn lên các giá
mang như Bacillus subtilis - một vi khuẩn có
khả năng tạo nội bào tử chống lại các điều
và thải tác nhân gây bệnh ra ao, hồ .
kiện khắc nghiệt của môi trưꢀng .
Hiện nay, cá mắc bệnh gan thận mủ được
điều trị với florfenicol hoặc sulfadimethoxine/
ormetoprim . Tuy nhiên, việc sử dụng kháng
sinh chữa bệnh lâu dài dẫn đến hiện tượng
kháng thuốc; đồng thꢀi, những tồn lưu kháng
sinh không mong muốn đã khiến cho việc
xuất khẩu thủy sản gặp nhiều khó khăn. Trên
thế giới, nhiều nghiên cứu về vaccin giúp
phòng ngừa bệnh gan thận mủ đã được phát
triển, chủ yếu là các vaccin vi khuẩn sống
Các nghiên cứu trước đây thực hiện theo
hướng neo kháng nguyên lên vỏ bào tử của B.
subtilis, hay biểu hiện protein kháng nguyên
dưới dạng tiết. Trong nghiên cứu này, nhóm
nghiên cứu tiến hành khảm protein kháng
nguyên fliC của E. ictaluri vào tiêm mao của B.
subtilis. Protein tiêm mao - flagella của B. subtilis
được mã hóa bởi gen hag, cấu trúc bậc 3 của
protein hag cho thấy vꢃng đầu N (acid amin 1-
143) và đầu C (acid amin 218-304) sꢂ gấp cuộn và
là vùng nhận diện của thụ thể Toll-like Receptor
5 (TLR5) trên tế bào. Các trình tự acid amin ở
giữa là vùng nhận biết của kháng thể, gây đáp
ứng miễn dịch đặc hiệu qua trung gian tế bào
lympho T, hình thành kháng thể có khả năng
bảo vệ vật chủ khi phơi nhiễm với kháng
giảm độc lực và vaccin bất hoạt . Tuy nhiên,
việc sử dụng vaccin sống lại gây tranh cãi vì
nguy cơ phát triển ngược thành dạng có độc
lực. Vì vậy, cần thiết phải phát triển vaccin tái tổ
hợp để tăng tính an toàn của biện pháp. Trong số
các kháng nguyên của E. ictaluri, protein màng
ngoài (Outer membrane protein - OMP),
nguyên . Sự dung hợp giúp cho việc trình diện
glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase
kháng nguyên fliC hiệu quả hơn thông qua thụ
thể TLR5 và khả năng tạo nội bào tử của B.
subtilis giúp cho quá trình sản xuất và bảo quản
vaccin thuận lợi hơn.
(GAPDH), và protein tiêm mao được chứng
minh có khả năng gây đáp ứng miễn dịch tốt,
đây là các ứng viên tiềm năng trong việc tạo
vaccin tái tổ hợp . Protein tiêm mao là một
kháng nguyên ứng viên với gen mã hóa cho
VẬTLIỆUVÀPHƯƠNGPHÁP
protein đã được xác định (fliC1, fliC2, fliC3 và
fliC4) . Nghiên cứu trước đây cũng cho thấy
protein này gây kích thích miễn dịch tốt trên cá.
Chủng chủ và plasmid
Escherichia coli DH5α được sử dụng làm
chủng tạo dòng. E. coli BL21(DE3) và B. subtilis
PY79 được sử dụng làm chủng biểu hiện.
Plasmid pUC57.FNG chứa trình tự đã tối ưu
hóa của gen fliC trong các nghiên cứu trước
Việc chủng ngừa hiện nay được thực hiện
bằng phương pháp tiêm hoặc ngâm trong
huyền phꢃ, tuy nhiên phương pháp tiêm gây
25
Chuyên Đề Dược
Nghiên cứu Y học
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019
o
của nhóm nghiên cứu. Plasmid pET28b(+)
được sử dụng để tạo vector tái tổ hợp cho
mục đích biểu hiện protein fliC. Plasmid
pDG364 được sử dụng để chèn đoạn gen
đích vào bộ gen của B. subtilis. Vi khuẩn và
plasmid được cung cấp bởi PTN Công nghệ
sinh học Dược, Khoa Dược, Đại học Y Dược
TP.Hồ Chí Minh.
16 giꢀ ở 4 C. Protein tái tổ hợp được kiểm tra
biểu hiện bằng phương pháp SDS-PAGE với
thuốc nhuộm Coomassive Blue và Western
Blot với kháng thể anti-His tag (Sigma).
Protein fliC tinh chế để phục vụ cho giai đoạn
tạo kháng thể anti-fliC IgG.
Tạo dòng B. subtilis mang protein fliC khảm
trong tiêm mao
Tạo dòng E. coli BL21(DE3) mang vector tái
tổ hợp pET28b(+).fliC
Gen fliC được thu nhận từ khuôn mẫu
pUC57.FNG, gen hagN và hagC được thu nhận
từ khuôn mẫu DNA nhiễm sắc thể (NST) B.
subtilis PY79 (Hình 1) bằng phản ứng PCR với
cặp mồi tương ứng (Bảng 1). Các gen hagN, fliC
và hagC được chèn vào vector pET28b(+) đã
được xử lý với enzym BamHI/HindIII bằng
phương pháp GoldenGate Assembly. Thu nhận
trình tự NFC bằng phản ứng PCR trên khuôn
Gen fliC được thu nhận từ khuôn mẫu
pUC57.FNG bằng phản ứng PCR với cặp mồi
tương ứng (Bảng 1). Gen fliC và vector
pET28b(+) được xử lý với cặp enzym
BamHI/HindIII, nối lại bằng T4 DNA Ligase và
biến nạp vào E. coli DH5α. Chủng tái tổ hợp
được sàng lọc bằng phản ứng PCR. Vector
pET28b(+).fliC được biến nạp vào E. coli
BL21(DE3) và sàng lọc chủng tái tổ hợp bằng
PCR với cặp mồi exp_fliC_F/exp_fliC_R.
mẫu
pET28b(+).NFC
với
cặp
mồi
hagN_F/hagC_R, xử lý NFC với enzym BsaI, nối
vào vector pDG364 đã được xử lý với
BamHI/HindIII bằng T4 DNA Ligase và biến nạp
vào E. coli DH5α. Chủng tái tổ hợp được sàng lọc
bằng PCR khuẩn lạc và kiểm tra lại bằng phản
ứng cắt plasmid với HindIII. Vector
pDG364.NFC được duỗi thẳng bằng XhoI và
biến nạp vào B. subtilis. Chủng tái tổ hợp được
sàng lọc bằng PCR với mồi hagN_F/hag_FliC_R
trên khuôn mẫu DNA NST và kiểm tra khả năng
thủy giải tinh bột trên môi trưꢀng thạch LB ( bổ
sung 1% tinh bột) để chứng minh vector
pDG364.NFC đã được tái tổ hợp vào locus amyE
của B. subtilis.
Cảm ứng biểu hiện và tinh sạch protein fliC
tái tổ hợp
Chủng E. coli BL21(DE3)/pET28b(+).fliC
được tăng sinh trong 100 ml LB và cảm ứng
o
biểu hiện với IPTG 1 mM trong 16 giꢀ ở 25 C.
Ly tâm thu cắn ở 10.000 g/5 phút. Ly giải cắn
vi khuẩn bằng tán siêu âm 30 giây/chu kꢄ (5
chu kꢄ). Ly tâm 10.000 g/5 phút thu protein ở
các pha tổng, tan và tủa. Thực hiện đồng thꢀi
với mẫu đối chứng âm không cảm ứng IPTG.
Sau khi xác định protein fliC hiện diện trong
pha nào, tinh chế protein đích bằng sắc ký ái
lực với cột Ni-Sepharose (GE Healthcare), thu
nhận bằng đệm thôi có nồng độ Imidazol 100
mM và thẩm tách loại muối qua màng MCO
6000-8000 kDa (Sigma) trong đệm PBS trong
FNG (660 bp)
(B)
(A)
NFC
NFC
AmyE
MCS
AmpR
(915 bp)
AmpR
pUC57.FNG
(3370 bp)
Cat
pD
(7394 bp)
G
3
6
4
.NF
C
AmyE’
hag (Bacillus subtilis)
aa 1 143
PCR
218
304
fliC (F)
hagN (N)
hagC (C)
Vùng biến động
Hình 1: Thiết kế trình tự NFC (A): cấp độ phân tử, (B): Vector pDG364.NFC
26
Chuyên Đề Dược
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019
Bảng 1: Danh sách mồi sử dụng trong nghiên cứu
Nghiên cứu Y học
Gen mục tiêu
Tên
Trình tự 5’-3’
Kꢀch thước
exp_fliC
exp_FliC_F
exp_FliC_R
hagN_F
GCTTGGATCCGacaggctctttggaactg
CTCCAAGCTTTCAatctgccgcaacagtaac
GGTCTCGGATCtgcagcagcgttatccagc
200 bp
hagN (N)
fliC (F)
685 bp
hagN_RGG
hag_FliC_F
hag_FliC_R
hagC_FGG
hagC_R
GAAGATCTGGAAGCGGTCTCTCAGtgcaggagtagctgtgtc
CTGTGGTCTCAACTGacaggctctttggaactg
200 bp
350 bp
CAGTGGTCTCACAGCatctgccgcaacagtaac
GAAGATCTGGTCTGTGGTCTCAgctgatatcggtttcgat
GGTCTCAAGCTcctggcaacgccaaggtc
hagC (C)
Chú thích: chữ thưꢀng: trình tự bắt cặp với DNA khuôn mẫu, chữ hoa: trình tự thêm vào đầu 5’, gạch dưới: trình tự
nhận diện của enzym cắt giới hạn, mồi do IDT tổng hợp.
Kiểm tra sự biểu hiện tiêm mao của chủng B.
subtilis tái tổ hợp
với enzym BamHI/HindIII. Hỗn hợp nối được
biến nạp vào E. coli DH5α và thu nhận được 5
khuẩn lạc tiềm năng bằng PCR khuẩn lạc với
cặp mồi exp_fliC_F/exp_fliC_R (giếng 1-5,
Hình 2A). Plasmid chiết được từ 5 chủng này
được kiểm tra lại bằng PCR với cặp mồi
exp_fliC_F/exp_fliC_R. Kết quả PCR (giếng 1-
5, Hình 2B) đều cho băng DNA đúng kích
thước của gen exp_fliC (200 bp). Như vậy, 5
Chủng B. subtilis tái tổ hợp được kiểm
tra khả năng di động trên thạch LB bán rắn
(0,4% agar) và biểu hiện của tiêm mao bằng
Western Blot với kháng thể anti-hag IgG
(kháng thể kháng protein tiêm mao hag của
B. subtilis do nhóm nghiên cứu tạo ra).
KẾTQUẢ
Tạo dòng E. coli BL21(DE3) mang vector tái
tổ hợp pET28b(+).exp_fliC
chủng
E.
coli
DH5α
mang
vector
pET28b(+).exp_fliC đã được tạo dòng thành
Gen exp_fliC (200 bp) và vector pET28b(+)
(5,4 kbp) được thu nhận thành công và xử lý
công, ký hiệu các chủng từ HY007-HY011.
(A)
(B)
(C)
M
1
2
3
4
5
C
M
1
2
3
4
5
C
M 1
2 3 4 5 6 C
500 bp
200 bp
200 bp
200 bp
200 bp
Hình 2: (A): Sản phẩm PCR khuẩn lạc sàng lọc chủng mang vector pET28b(+).exp_fliC, (B): Sản phẩm
PCR với các plasmid chiết từ các khuẩn lạc tiềm năng, (C): Sản phẩm PCR kiểm tra chủng E. coli
BL21(DE3) mang vector tái tổ hợp pET28b(+).exp_fliC.
băng tương ứng với băng DNA của chứng
dương pUC57.FNG (giếng C, Hình 2C) và
đúng kích thước của gen exp_fliC (200 bp).
Như vậy, 6 chủng E. coli BL21(DE3) mang
vector pET28b(+).exp_fliC đã được tạo dòng
thành công, ký hiệu chủng là HY012-HY017.
Plasmid pHY010 chiết từ chủng E. coli
HY010 được chọn để biến nạp vào E. coli
BL21(DE3). 6 khuẩn lạc mọc trên LBAK30
được lựa chọn ngẫu nhiên để chiết plasmid
và kiểm tra bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu.
Kết quả PCR (giếng 1-6, Hình 2C) đều cho
27
Chuyên Đề Dược
Nghiên cứu Y học
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019
Kiểm tra biểu hiện và tinh sạch protein fliC
tái tổ hợp
ứng với kích thước protein fliC (10,5 kDa) dự
đoán và không thấy sự xuất hiện của băng
protein này ở chứng âm (Hình 3A). Mặt khác,
4 chủng biểu hiện mạnh HY014-HY017 được
chọn để phân tích protein pha tan và pha
tủa, nhận thấy mẫu protein nằm ở pha tan
(Hình 3B).
Kết quả biểu hiện protein fliC bởi 6 chủng
HY012-HY017 được kiểm tra trên gel SDS-
PAGE 18% cho thấy mẫu protein pha tổng ở
các chủng có cảm ứng IPTG đều xuất hiện
băng protein kích thước khoảng 11 kDa, tương
(B)
(A)
F0 HY012 HY013 HY014
M
HY015 HY016 HY017
(C)
M
FliC
F0 SHY014IHY014SHY015IHY015 M SHY016 IHY016 SHY017IHY017
11 kDa
11 kDa
11 kDa
Hình 3: (A): Phân tích biểu hiện protein fliC ở các chủng E. coli BL21(DE3) tái tổ hợp, (B): Phân tích biểu
hiện xác định trạng thái của protein fliC, (C): Kết quả Western Blot với kháng thể anti-his tag. M: protein
marker Opti-XL, F0: chủng không cảm ứng IPTG, S: pha tan, I: pha tủa.
bằng phản ứng PCR (Hình 4A). Hỗn hợp nối
của N, F, C và pET28b(+) đã được xử lý với
BamHI/HindIII được biến nạp vào E. coli DH5α
và thu nhận được 4 khuẩn lạc tiềm năng bằng
phương pháp PCR khuẩn lạc với cặp mồi
hagN_F/hagC_R (giếng 1-3 và 6, Hình 4B), 2
khuẩn lạc ở giếng 4 và 5 (Hình 4B) không có
đoạn chèn. Kết quả kiểm tra bằng phản ứng
cắt với BamHI cho thấy plasmid mở vòng của
4 khuẩn lạc này có băng DNA kích thước
khoảng 6,6 kbp và lớn hơn kích thước của
vector pET28b(+) (Hình 4C). Như vậy, 4 chủng
E. coli mang vector pET28b(+).NFC đã được
tạo dòng thành công, ký hiệu các chủng từ
HY018-HY021.
Chủng HY014 được lựa chọn cảm ứng
biểu hiện với thể tích 100 ml, dịch ly giải mẫu
được xử lý theo quy trình của protein pha tan
và tinh chế qua cột Ni-Sepharose. Mẫu protein
sau khi thẩm tích được xác định nồng độ bằng
phương pháp Bradford. Nồng độ protein thu
được 250 µg/ml. Kết quả kiểm tra bằng
Western Blot với kháng thể anti-His tag dương
tính ở vị trí 11kDa (Hình 3C), cho thấy protein
biểu hiện ở vị trí 11 kDa có đuôi his-tag và là
protein fliC mong muốn.
Tạo dòng B. subtilis mang protein fliC khảm
trong tiêm mao
Gen hagN (N) (685 bp), fliC (F) (200 bp) và
hagC (C) (350 bp) được thu nhận thành công
HY HY HY HY
(C)
(A)
(B)
M
1
2
3
4
5
6
C
M N F C
M
pET
018 019 020 021
6,6 kbp
5,4 kbp
5 kbp
3 kbp
685 bp
1,2 kbp
1 kbp
500 bp
200 bp
350 bp
200 bp
Hình 4: (A): Thu nhận gen hagN (N), fliC (F) và hagC (C), (B): Sản phẩm PCR khuẩn lạc sàng lọc chủng
mang pET28b(+).NFC, C: sản phẩm PCR chứng dương DNA NST B. subtilis PY79,
(C): Kết quả cắt kiểm tra các plasmid pET28b(+).NFC với BamHI.
28
Chuyên Đề Dược
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019
Nghiên cứu Y học
HindIII cho thấy plasmid mở vòng của 2
khuẩn lạc này có kích thước khoảng 7,4 kbp và
lớn hơn kích thước của pDG364 (6,2 kbp)
(Hình 5C). Vậy, 2 chủng E. coli DH5α mang
vector pDG364.NFC đã được tạo dòng thành
công, ký hiệu chủng là HY022 và HY023.
Gen NFC (1,2 kbp) được thu nhận thành
công bằng PCR trên khuôn mẫu pHY018
(Hình 5A). Hỗn hợp nối giữa NFC và pDG364
được biến nạp vào E. coli DH5α, thu nhận
được 2 chủng tiềm năng bằng PCR khuẩn lạc
với mồi hagN_F/hagC_R (giếng 1-13) (Hình
5B). Kết quả kiểm tra bằng phản ứng cắt với
HY HY
022 023
(C)
pDG
364
(A)
(B)
M
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213 C
M NFC
7,4 kbp
6,2 kbp
6 kbp
3 kbp
1,15 kbp
1 kbp
1 kbp
1,15 kbp
Hình 5: (A): Thu nhận gen NFC, (B): Sản phẩm PCR khuẩn lạc sàng lọc chủng mang pDG364.NFC,
C: sản phẩm PCR chứng dương DNA NST B. subtilis PY79,(C): Kết quả cắt kiểm tra plasmid chiết được với
HindIII
plasmid pHY023. pHY023 được biến nạp vào
B. subtilis, lựa chọn ngẫu nhiên 12 khuẩn lạc
mọc trên LBAC5 tăng sinh chiết DNA NST để
kiểm tra bằng phản ứng PCR với cặp mồi
hagN_F/hag_FliC_R.
Plasmid pHY022 và pHY023 được gửi giải
trình tự ở công ty PhuSa Biochem. Kết quả
pHY022 ghi nhận 3 đột biến điểm tuy nhiên
không làm thay đổi trình tự acid amin;
pHY023 không có đột biến. Do đó, tiếp tục tiến
hành chuyển gen NFC vào B. subtilis bằng
(A)
(B)
M 1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11
12 C
1 kbp
0,89 kbp
Hình 6: (A): Sản phẩm PCR sàng lọc chủng B. subtilis mang trình tự NFC, (B): Kết quả kiểm tra khả năng
thủy giải tinh bột của 12 chủng B. subtilis tái tổ hợp, C: B. subtilis PY79 WT
đồng thꢀi cũng mất khả năng thủy giải tinh
bột vì được chèn vào locus amyE của B. subtilis
(Hình 6B). Như vậy, 12 chủng B. subtilis tái tổ
hợp đã được tạo dòng thành công, ký hiệu
chủng là HY024-HY035.
Kết quả cho thấy 12 khuẩn lạc thu nhận
đều cho sản phẩm PCR có kích thước khoảng
0,89 kbp và tương đương với chứng dương là
sản phẩm PCR từ khuôn mẫu pHY023 chiết từ
chủng (Hình 6A). 12 khuẩn lạc tiềm năng
29
Chuyên Đề Dược
Nghiên cứu Y học
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019
Kiểm tra khả năng biểu hiện tiêm mao của chủng B. subtilis tái tổ hợp
(A)
(B)
M C
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12
36 kDa
Hình 7: (A): Kết quả kiểm tra di động trên thạch bán rắn các chủng HY024-HY035, (B): Kết quả Western Blot
với kháng thể anti-hag IgG dịch chiết flagella các chủng HY024-HY035.
Kết quả kiểm tra di động (Hình 7A) cho
thấy các chủng đều di động, tuy nhiên chủng
HY028, HY033 và HY035 ghi nhận sự di động
yếu hơn so với chủng hoang dại.
không phải protein thiết yếu nên những biến
đổi di truyền không làm ảnh hưởng đến sự
sống của vi khuẩn . Điều này được thể hiện
qua kết quả của đề tài khi đã tạo dòng thành
công chủng B. subtilis mang protein fliC dung
hợp trong tiêm mao mà vẫn biểu hiện tiêm
mao và di động bình thưꢀng. Protein tiêm
mao fliC của E. ictaluri được sử dụng làm
kháng nguyên, dung hợp vào protein hag của
B. subtilis. Khi đó, B. subtilis trở thành giá
mang kháng nguyên. Vi khuẩn này sꢂ được
lên men và thu nhận ở dạng bào tử. Khi sử
dụng, vaccin là bào tử B. subtilis được trộn với
thức ăn và chủng ngừa bằng cách cho cá ăn,
bào tử sau đó sꢂ nảy mầm khi vào môi trưꢀng
nước hoặc ruột cá và sꢂ biểu hiện kháng
nguyên protein tiêm mao của E. ictaluri gây ra
những đáp ứng miễn dịch đặc hiệu, bảo vệ
đàn cá trước tác nhân gây bệnh.
Đồng thꢀi kết quả Western Blot tiêm mao
chiết được với kháng thể anti-hag IgG (Hình
7B) cho thấy các chủng có khả năng biểu hiện
tiêm mao, tuy nhiên mức độ biểu hiện cũng có
sự khác biệt so với chủng B. subtilis PY79
hoang dại (giếng C, Hình 7B), trong đó chủng
HY025-HY027, HY033 (giếng 2-4 và giếng 10,
Hình 7B) biểu hiện yếu hơn, các chủng HY030-
HY032, HY034, HY035 (giếng 7-9, giếng 11,12,
Hình 7B) biểu hiện mạnh hơn và các chủng
còn lại có mức độ biểu hiện tương đương.
BÀNLUẬN
Trên thế giới đã có nhiều báo cáo cho thấy
tiêm mao là yếu tố gây độc của nhiều loài vi
khuẩn gây bệnh ở cá như Vibrio anguillarum, V.
fischeri, Aeromonas hydrophila, E. tarda. Cụ thể,
Jiao đã tạo thành công vaccin từ fliC của E.
tarda dưới dạng protein tái tổ hợp và vaccin
DNA, trong đó dạng vaccin DNA của kháng
nguyên Eta6 hoặc Et18 kết hợp với fliC cho
KẾTLUẬN
Protein fliC có kích thước 11 kDa đã được
biểu hiện và tinh chế thành công với lượng 1,5
mg để phục vụ cho giai đoạn tạo kháng thể
anti-fliC IgG. Đồng thꢀi, nghiên cứu thu nhận
được 12 chủng B. subtilis tái tổ hợp mang
protein fliC khảm trong tiêm mao làm tiền đề
cho thử nghiệm hiệu quả phòng ngừa bệnh
gan thận mủ trên mô hình in vivo.
hiệu quả cao nhất . Tuy nhiên, hiện vẫn chưa
có nghiên cứu nào về vaccin tái tổ hợp từ
protein fliC của E. ictaluri.
Protein hag của B. subtilis là một protein
được biểu hiện nhiều nhất trong tế bào và
Lꢁi cảm ơn: Nghiên cứu này sử dụng kinh phí của đề tài số
240/2017/HĐ-SKHCN do Sở Khoa học và Công nghệ TP. Hồ
Chí Minh cấp cho Vũ Thanh Thảo.
30
Chuyên Đề Dược
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019
Nghiên cứu Y học
8. Park SB, Jang HB, Nho SW, et al. (2011), "Outer membrane
vesicles as a candidate vaccine against edwardsiellosis",
PLoS One. 6(3), e17629.
TÀILIỆUTHAMKHẢO
1. Commichau FM, Pietack N, Stulke J (2013), "Essential
genes in Bacillus subtilis: a re-evaluation after ten years",
Mol Biosyst. 9(6), pp.1068-1075.
2. Crumlish M, Dung TT,. Turnbull JF, et al. (2002),
"Identification of Edwardsiella ictaluri from diseased
freshwater catfish, Pangasius hypophthalmus (Sauvage),
cultured in the Mekong Delta, Vietnam", Journal of Fish
Diseases. 25(12), pp.733-736.
9. Pridgeon JW, Klesius PH (2011), "Development of
a
novobiocin-resistant Edwardsiella ictaluri as a novel vaccine
in channel catfish (Ictalurus punctatus)", Vaccine. 29(34),
pp.5631-5637.
10. Smith K., Andersen-Nissen E, Hayashi F, et al. (2003),
"Toll-like receptor 5 recognizes a conserved site on flagellin
required for protofilament formation and bacterial
motility", Nat Immunol. 4(12), pp.1247-1253.
11. Sommerset I, Krossoy B, Biering E, et al. (2005), "Vaccines
for fish in aquaculture", Expert Rev Vaccines. 4(1), pp.89-101.
12. Tu TD, Haesebrouck F, Nguyen AT, et al. (2008),
"Antimicrobial susceptibility pattern of Edwardsiella ictaluri
isolates from natural outbreaks of bacillary necrosis of
Pangasianodon hypophthalmus in Vietnam", Microb Drug
Resist. 14(4), pp.311-316.
3. Cutting SM (2011), "Bacillus probiotics", Food Microbiol.
28(2), pp.214-220.
4. Hawke JP (2015), "Enteric Septicemia of Catfish". SRAC
Publication No. 477. Southern Regional Aquaculture
Center, MSU. Mississippi, United States of America. 6p.
5. Jiao XD, Zhang M, Hu YH, et al. (2009), "Construction and
evaluation of DNA vaccines encoding Edwardsiella tarda
antigens", Vaccine. 27(38), pp.5195-5202.
6. Mukherjee S, Babitzke P, Kearns DB (2013), "FliW and FliS
function independently to control cytoplasmic flagellin
levels in Bacillus subtilis", J Bacteriol. 195(2), pp.297-306.
7. Panangala VS, Russo R, Santen VLV, et al. (2009),
"Organization and sequence of four flagellin‐encoding
genes of Edwardsiella ictaluri", Aquaculture Research. 40(10),
pp.1135-1147.
Ngày nhận bài báo:
18/10/2018
01/11/2018
15/03/2019
Ngày phản biện nhận xét bài báo:
Ngày bài báo được đăng:
31
Chuyên Đề Dược
8 trang
09/01/2024
16960
Free
Bạn đang xem tài liệu "Tạo dòng kháng nguyên Flic của Edwardsiella ictaluri khảm trong tiêm mao của Bacillus subtilis", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên
File đính kèm:
- tao_dong_khang_nguyen_flic_cua_edwardsiella_ictaluri_kham_tr.pdf
