Xây dựng quy trình phát hiện nhanh ngô chứa gen CRY1AB dựa trên kỹ thuật LAMP
Tạp chí Khoa học Công nghệ và Thực phẩm 20 (1) (2020) 37-45
XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN NHANH NGÔ
CHỨA GEN Cry1Ab DỰA TRÊN KỸ THUẬT LAMP
Hồ Viết Thế1*, Trần Thị Mỹ Hạnh2, Nguyễn Thị An1,
Ngô Thị Kim Anh1, Nguyễn Thị Hương1, Lê Ngọc Giàu1
1Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP. Hồ Chí Minh
2Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh (HUTECH)
*Email: thehv@hufi.edu.vn
Ngày nhận bài: 26/11/2019; Ngày chấp nhận đăng: 21/02/2020
TÓM TẮT
Việt Nam đã cho phép trồng ngô biến đổi gen có chứa gen Cry1Ab để tăng khả năng
kháng sâu đục thân. Tuy nhiên, vẫn còn nhiều ý kiến tranh cãi về mức độ an toàn của loại cây
trồng mới này, vì vậy đã có nhiều phương pháp sử dụng để phát hiện sự hiện diện của gen
Cry1Ab trong cây ngô. Các phương pháp hiện tại phần lớn đều phụ thuộc nhiều vào trang thiết
bị phòng thí nghiệm và khó thực hiện ngoài thực địa. Gần đây, kỹ thuật khuếch đại DNA đẳng
nhiệt LAMP (Loop Mediated Isothermal Amplification) đã được sử dụng để phát hiện nhanh
các đối tượng gây bệnh trên người và vật nuôi một cách nhanh chóng, với độ chính xác cao và
ít yêu cầu về trang thiết bị đắt tiền. Trong nghiên cứu này, quy trình phát hiện ngô biến đổi
gen bằng kỹ thuật LAMP đã được xây dựng thành công thông qua khảo sát các yếu tố ảnh
hưởng tới phản ứng. Kết quả cho thấy nồng độ phù hợp của các mồi FIP/BIP và F3/B3 là
0,4 µM với nhiệt độ phản ứng phù hợp ở 60 °C. Ngoài ra, qua khảo sát về ngưỡng phát hiện
của phương pháp LAMP so với phương pháp Realtime PCR cũng cho thấy độ nhạy của phản
ứng LAMP cao hơn phản ứng Realtime PCR. Ngoài ra, khi sử dụng thuốc nhuộm HNB ở nồng
độ 80 µM, có thể phân biệt được giữa ngô không chuyển gen và ngô chứa gen Cry1Ab. Kết
quả này là tiền đề để thiết kế KIT phát hiện ngô biến đổi gen ngoài thực địa.
Từ khóa: Biến đổi gen, Cry1Ab, LAMP, ngô, Realtime PCR.
1. MỞ ĐẦU
Trên thế giới, các cây lương thực như lúa, ngô biến đổi gen hay các cây công nghiệp như
đậu nành, bông biến đổi gen được trồng phổ biến với diện tích lớn [1], các cây trồng được
thương mại hóa nhiều ở các nước có nền nông nghiệp phát triển như Mỹ, Brazil, Argentina,
Canada, Ấn Độ [2]. Năm 2018, cây trồng biến đổi gen đã được trồng ở 26 quốc gia với diện
tích 191,7 triệu ha, tăng khoảng 113 lần so với năm 1996 [2]. Tháng 3 năm 2015, Cục Trồng
trọt, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã cho phép sản xuất thương mại 3 giống ngô
biến đổi gen, điều này đã giúp Việt Nam trở thành quốc gia thứ 29 trên thế giới thương mại
hóa cây trồng sử dụng công nghệ sinh học [3]. Từ năm 2015, nước ta có 3 giống ngô biến đổi
gen được trồng ngoài đồng ruộng: thứ nhất chứa gen Cry1Ab kháng sâu đục thân, giống thứ
hai chứa gen GA21 kháng thuốc diệt cỏ phổ rộng glyphosate, và giống thứ ba chứa đồng thời
cả 2 gen Cry1Ab và GA21 nên có khả năng kháng sâu đục thân và thuốc diệt cỏ ở các vùng
trên cả nước. Ngày 18/3/2015, Bộ Nông nghiệp vào Phát triển nông thôn đã chính thức công
nhận ba giống ngô biến đổi gen của Công ty Syngenta để trồng phổ biến ở nước ta bao gồm:
NK66 Bt, NK66 GT và NK66 Bt/GT. Trong đó, giống NK66 Bt và NK66 Bt/GT mang gen
Cry1Ab có khả năng phòng trừ sâu đục thân cao, có khả năng kháng sâu ở tất cả các bộ phận
37
Hồ Viết Thế, Trần Thị Mỹ Hạnh, Nguyễn Thị An, Ngô Thị Kim Anh, Nguyễn Thị Hương...
của cây. Giống NK66 GT và giống NK66 Bt/GT mang gen mã hóa enzyme EPSP synthase có
khả năng chống chịu cao đối với thuốc trừ cỏ glyphosate nên mang lại hiệu quả trừ cỏ rõ rệt
khi sử dụng loại thuốc diệt cỏ này. Cả 3 giống ngô biến đổi gen này đều cho năng suất cao hơn
so với giống nền đối chứng và chất lượng sản phẩm cũng tốt hơn thông qua việc sản phẩm ít
bị hư hại do sâu đục thân gây ra [23]. Hiện nay, giống ngô chứa gen Cry1Ab được sử dụng
phổ biến hơn do có khả năng giảm nhu cầu sử dụng thuốc diệt sâu bộ cánh vảy. Khi chuyển
vào cây, gen Cry1Ab sẽ tạo ra tinh thể protein Cry1Ab, nhưng tinh thể này sẽ tạo thành độc
tính khi vào trong hệ tiêu hóa của côn trùng, trong khi đó protein này đã được chứng minh an
toàn đối với người và các động vật khác.
Mặc dù các giống ngô chuyển gen đem lại hiệu quả lớn về năng suất và chất lượng sản
phẩm, nhưng trên thế giới nói chung và nước ta nói riêng vẫn có những ý kiến trái chiều về
giống ngô này. Những tranh cãi về mức độ an toàn thực phẩm, ảnh hưởng tới môi trường và
những vấn đề liên quan đến đạo đức đối với loại cây trồng này diễn ra ở nhiều nơi, điều này
dẫn tới hơn 50 nước trên thế giới yêu cầu phải dán nhãn sản phẩm có chứa thành phần từ sinh
vật biến đổi gen [4]. Theo Trung tâm Thông tin Phát triển Nông nghiệp Nông thôn, qua khảo
sát của Trung tâm Tiêu chuẩn và Đo lường chất lượng (Quatest 3) năm 2010, có 111/323
(chiếm gần 34,4%) mẫu nông sản và thực phẩm thu thập ở 17 chợ dương tính với dạng
promoter 35S hoặc dạng terminator NOS - một dạng chỉ thị của sản phẩm biến đổi gen. Trong
đó, có 45 mẫu ngô, 29 mẫu đậu nành, 10 mẫu cà chua, 15 mẫu khoai tây [5]. Nhiều trẻ em ở
Mỹ và châu Âu được chẩn đoán bị dị ứng khi ăn đậu phộng và nhiều thực phẩm biến đổi gen
khác. Một số gen được đưa vào cây trồng tạo ra protein gây dị ứng. Do đó, nhiều quốc gia đã
yêu cầu dán nhãn trên bao bì đối với các thực phẩm có nguyên liệu từ sinh vật biến đổi gen để
người tiêu dùng và nhà sản xuất có quyền lựa chọn [6].
Hiện tại, có nhiều phương pháp phát hiện nguyên liệu thực phẩm có chứa thành phần
biến đổi gen như PCR (polymerase chain reaction), Realtime PCR, ELISA (enzyme-linked
immunosorbent assay) [7, 8]. Tuy nhiên, các phương pháp này có nhược điểm phụ thuộc quá
nhiều vào các thiết bị hiện đại đắt tiền và chỉ phân tích được ở trong phòng thí nghiệm. Yêu
cầu thực tế cần phát triển một phương pháp phát hiện nguyên liệu thực phẩm biển đổi gen có
tính di động cao để có thể xác định ở trên cánh đồng hoặc từ chợ, siêu thị… Từ năm 2000,
Notomi và cộng sự đã nghiên cứu thành công kỹ thuật LAMP (loop mediated isothermal
amplification), có thể phát hiện đoạn DNA đặc hiệu chính xác, nhanh chóng, đơn giản có thể
thu nhận kết quả ngay tại hiện trường [9]. Kỹ thuật này đã được sử dụng thành công để phát
hiện các loại sinh vật gây bệnh ở nhiều nơi trên thế giới và ở Việt Nam [10-12]. Nghiên cứu
này đã bước đầu xây dựng quy trình phát hiện ngô biến đổi gen bằng kỹ thuật LAMP thông
qua sự hiện diện của gen Cry1Ab. Đây là tiền đề để có thể phát triển bộ KIT nhằm giúp việc
kiểm tra, xác định sự hiện diện của cây trồng biến đổi gen ngoài đồng ruộng hoặc các sản
phẩm biến đổi gen từ thực phẩm trên thị trường.
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
Giống ngô NK66 BT/GT mang gen Cry1Ab kháng sâu bộ cánh vảy được sử dụng làm
đối chứng dương, trong khi đó giống ngô NK66 không chứa gen được sử dụng làm đối chứng
âm. Cả 2 giống ngô này đều do Công ty TNHH Syngenta Việt Nam cung cấp.
2.2. Phương pháp
2.2.1. Ly trích DNA
Mẫu ngô NK66 BT/GT được sử dụng tách chiết DNA bằng quy trình của Bùi Minh Trí và
Bùi Cách Tuyến [13]. Để tăng hiệu quả của quá trình, quy trình ly trích đã được thay đổi thời
38
Xây dựng quy trình phát hiện nhanh ngô chứa gen Cry1Ab dựa trên kỹ thuật LAMP
gian ủ mẫu với đệm ly trích DNA và SDS 10% từ 1 giờ thành 24 giờ. Sau khi ly trích, DNA
được định tính bằng phương pháp điện di với điện thế 110V trong 20 phút sau đó phân tích
hình ảnh với máy chụp gel Quantum - ST4 3000 (Montreal-Biotech, Canada) dưới tia cực tím
và định lượng bằng phương pháp đo mật độ quang với định lượng bằng phương pháp đo quang
phổ (Optima SP-3000, Nhật Bản) ở bước sóng 260 nm và 280 nm.
2.2.2. Thiết kế mồi và tối ưu phản ứng LAMP
Mồi LAMP được thiết kế dựa trên trình tự gen Cry1Ab mục tiêu ở ngân hàng gen với số hiệu
X54939 [14] bằng chương trình với Explorer version 4.0 (https://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/)
với các thông số mặc định. Sau khi thu được các bộ mồi, phản ứng LAMP được tối ưu hóa
bằng việc khảo sát nồng độ mồi phù hợp cho phản ứng thông qua thay đổi tỷ lệ các mồi F3/B3
và FIP/BIP lần lượt là 0,2; 0,4; 0,6 và 0,8 µM; nhiệt độ tối ưu cho phản ứng LAMP được khảo
sát từ 60 °C đến 65 °C. Tổng thể tích của phản ứng LAMP 25 µL bao gồm: mồi F3/B3,
FIP/BIP; 15 µL Isothermal Master Mix 1X (Optigen, Anh); 1 µL DNA (40 ng/µL).
2.2.3. Xác định ngưỡng phát hiện
Thành phần phản ứng LAMP bao gồm: mồi F3/B3, FIP/BIP 0,4 µM; 15 µL Isothermal
Master Mixes (Optigen, Anh); 1 µL DNA ở các nồng độ lần lượt như sau: 1: 400 ng/µL;
2: 100 ng/µL; 3: 25 ng/µL; 4: 6,25 ng/µL; 5: 1,56 ng/µL; 6: 0,4 ng/µL; 7: 0,1 ng/µL; 8: 0,025 ng/µL
sau đó thêm nước loại ion cho tới 25 µL. Hỗn hợp được ủ ở 60 °C trong 60 phút. Các hỗn hợp
phản ứng được ủ ở 65 °C trong 60 phút trong máy PCR (SureCycler 8800 Thermal Cycler-
Agilent, Mỹ). Cuối cùng, kết quả phản ứng LAMP được nhận biết bằng phương pháp điện di
trên gel agarose 1,5% và nhận biết trực tiếp bằng thuốc nhuộm GelRedTM.
Tiếp theo, kỹ thuật Realtime PCR được sử dụng để so sánh ngưỡng phát hiện, thành phần
hóa phản ứng như sau: mồi xuôi và mồi ngược 25 µM, 12,5 µL GoTaq qPCR Master Mix 2X
(Promega, Mỹ); DNA chuẩn có chứa gen mục tiêu (Công ty Khoa Thương, TP. Hồ Chí Minh)
được pha loãng và bổ sung vào các phản ứng với các nồng độ cuối ở các phản ứng như sau 1:
400 ng/µL; 2: 100 ng/µL; 3: 25 ng/µL; 4: 6,25 ng/µL; 5: 1,56 ng/µL; 6: 0,4 ng/µL; 7: 0,1 ng/µL;
8: 0,025 ng/µL, sau đó thêm nước loại ion cho tới 25 µL. Trình tự mồi cho phản ứng: mồi xuôi
CGCTCCAAGCCAGTGTT; mồi ngược CCCATTGTTCGCAGTCC theo quy trình của
Rahman và cộng sự [15]. Phản ứng được thực hiện với chu kỳ nhiệt: biến tính ban đầu ở 95 °C
trong 2 phút, tiếp sau đó là 40 chu kỳ bắt đầu với biến tính ở 95 °C trong 15 giây, bắt cặp và
kéo dài ở 60 °C trong 60 giây trong máy Realtime PCR Mx3005P (Agilent, Mỹ). Độ chuyên
biệt của sản phầm được xác định qua phân tích đường cong nóng chảy của sản phẩm.
Bảng 1. Trình tự mồi cho phản ứng LAMP
Tên mồi
F-1
Trình tự mồi (5’ – 3’)
AGTTGCTGTACTTGTCGCGGA
B-1
TGTCCGTGTACGTTCAAGCAGC
FIP-1
BIP-1
F-2
AGAGAGTGGGAAGCCGATCCTACTAACCCAGCTCTCCG
AGCTCTGCAATCGCACAAACCCGTTTCCACCCCTAAGC
TCTCGCCTTGGCAACTAAGGAA
B-2
AATGTGCCACCCAGGCAAGG
FIP-2
BIP-2
CCAGCAACTTTCCGTTCTTGACGGAACAGAGTTCGCCT
AGGTACAAGGCAAGGCCTTGTCAAGGCACTCGTAGTAG
39
Hồ Viết Thế, Trần Thị Mỹ Hạnh, Nguyễn Thị An, Ngô Thị Kim Anh, Nguyễn Thị Hương...
F-3
B-3
TGTGTCAAAGACGAGTCGCTCA
CCAGGTGCTGGGTTCGTTCT
FIP-3
BIP-3
F-4
TGCCTGAGTAACCCAGAAGTGTGGCGAACGCATTGAAAC
CCAGGTAGAGTTACCCTACGAAGGACCACGTTTAACTCGT
TTGTCGCGGAACTGGTGTCG
B-4
TGTCCGTGTACGTTCAAGCAGC
FIP-4
BIP-4
GTGGGAAGCCGATCCTACTAGCTCTCCGCGAGGAAAT
CTCTGCAATCGCACAAACCCGTTTCCACCCCTAAGCTACG
2.2.4. Thử nghiệm khả năng phát hiện trực tiếp của phản ứng LAMP
Phản ứng LAMP được thực hiện với máy PCR (SureCycler 8800 Thermal Cycler-Agilent,
Mỹ) ở 60 °C trong 1 giờ với tổng thể tích phản ứng là 13 µL theo như tỷ lệ các thành phần phản
ứng sau đây: 0,5 µL mỗi loại mồi (FIP/BIP/F3/B3) với nồng độ 0,4 µM; 7,5 µL Isothermal
Master Mixes (Optigen, Anh); 1 µL DNA mẫu nồng độ 0,1 ng/µL và 2,5 µL nước cất dùng cho
phản ứng PCR. Sau khi phản ứng hoàn thành, tiếp tục bổ sung HNB (hydroxyl-naphthol-blue)
(Sigma-Aldrid, Mỹ) ở các nồng độ 20 µM, 40 µM, 80 µM, và 160 µM để xác định nồng độ thuốc
nhuộm phù hợp cho việc phát hiện diện của gen Cry1Ab bằng mắt thường.
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Xác định nồng độ của mồi
Sau khi sử dụng phần mềm Primer explorer để thiết kế LAMP mồi cho gen Cry1Ab, kết
quả thu được 4 bộ mồi có các thông số kỹ thuật tốt nhất (Bảng 1). Qua sàng lọc ban đầu, bộ
mồi thứ 4 cho hiệu quả phản ứng tốt nhất và bộ mồi này được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp
theo. Trong phản ứng LAMP, việc tối ưu hóa nồng độ mồi có vai trò rất quan trọng, các mồi
trong phản ứng LAMP không hoạt động riêng lẻ như phản ứng PCR mà chúng kết hợp với
nhau để bắt cặp với DNA mục tiêu và khuếch đại tạo thành các bản sao của DNA. Vì vậy, việc
xác định lượng mồi bổ sung vào phản ứng hay tỷ lệ giữa các mồi với nhau là quan trọng. Do đó,
tiến hành khảo sát và chọn nồng độ tối ưu của các mồi. Kết quả điện di được thể hiện ở Hình 1.
Hình 1. Kết quả khảo sát nồng độ 2 cặp mồi F3/B3 và FIP/BIP cho gen Cry1Ab
(13: Đối chứng âm)
Kết quả điện di sản phẩm phản ứng LAMP trong việc khảo sát nồng độ 2 cặp mồi F3/B3,
FIP/BIP cho thấy, tất cả các nghiệm thức đều có kết quả. Kết quả này phù hợp với các nghiên
cứu về nồng độ của các mồi trong kỹ thuật LAMP được công bố trước đây của Zhou và cộng
sự [16]. Kết quả này cũng cho thấy, phản ứng LAMP có thể hoạt động tốt ở nồng độ thấp hơn
40
Xây dựng quy trình phát hiện nhanh ngô chứa gen Cry1Ab dựa trên kỹ thuật LAMP
so với ở một số nghiên cứu gần đây [10, 17]. Với kết quả đạt được ở thí nghiệm này, nồng độ mồi
FIP/BIP: 0,4 µM, F3/B3: 0,4 µM (giếng số 6) được chọn để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.
3.2. Tối ưu nhiệt độ bắt cặp cho phản ứng LAMP
Sau khi xác định được nồng độ các cặp mồi phù hợp, thí nghiệm tiếp theo được thực hiện
để đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ tới phản ứng LAMP. Kết quả cho điện di sản phẩm LAMP
xuất hiện các băng vạch rõ và đều (Hình 2).
Hình 2. Kết quả khảo sát nhiệt độ phản ứng LAMP của bộ mồi 4
(M: thang chuẩn DNA 1000 bp; từ 1 đến 6: nhiệt độ từ 60 °C đến 65 °C)
Sau khi thực hiện phản ứng LAMP với nhiệt độ dao động từ 60 °C đến 65 °C, các mẫu
thử nghiệm đều xuất hiện các band vạch đặc trưng và không có sự khác nhau quá lớn giữa các
nhiệt độ phản ứng. Có thể kết luận rằng nhiệt độ tối ưu để thực hiện phản ứng LAMP là khoảng
nhiệt độ từ 60 °C đến 65 °C. Kết quả thu đuợc có sự tương đồng khi so sánh với kết quả nghiên
cứu trước của Zhen và cộng sự về khảo sát phản ứng LAMP với nhiệt độ tối ưu (61 °C, 63 °C,
65 °C) [17].
3.3. So sánh ngưỡng phát hiện của LAMP với Realtime PCR
Sau khi xác định được cặp mồi phù hợp, thí nghiệm tiếp theo được tiến hành để so sánh
ngưỡng phát hiện của phương pháp LAMP so với phương pháp Realtime PCR. Kết quả được
thể hiện ở Hình 3.
Hình 3. So sánh ngưỡng phát hiện bằng Realtime PCR (A) và LAMP (B)
(Nồng độ DNA: 1: 400 ng/µL; 2: 100 ng/µL; 3: 25 ng/µL; 4: 6,25 ng/µL; 5: 1,56 ng/µL;
6: 0,4 ng/µL; 7: 0,1 ng/µL; 8: 0,025 ng/ µL)
Kết quả điện di sản phẩm phản ứng LAMP cho thấy, phương pháp LAMP cho kết quả phản
ứng từ mức độ pha loãng cao nhất (400 ng/µL) đến mức độ pha loãng thấp nhất (0,025 ng/µL).
Kết quả này tương tự với nghiên cứu của Zahradnik và cộng sự khi sử dụng kỹ thuật LAMP
để xác định ngô biến đổi gen thông qua sự hiện diện của promoter 35S [18]. Ngoài ra, nghiên
cứu của Ghosh và cộng sự tại Ấn Độ cho thấy, LAMP có khả năng phát hiện gen mục tiêu ở
41
Hồ Viết Thế, Trần Thị Mỹ Hạnh, Nguyễn Thị An, Ngô Thị Kim Anh, Nguyễn Thị Hương...
nấm bệnh ở mức 10 fg DNA trong một phản ứng [21]. Trong khi đó, ở phản ứng Realtime
PCR, sản phẩm khuếch đại chỉ xuất hiện ở bậc pha loãng thứ 6 (0,4 ng/µL), ở các bậc pha
loãng thấp hơn (6: 0,1 ng/µL và 6: 0,025 ng/µL) không thấy có sự xuất hiện của đường cong
khuếch đại của sản phẩm mục tiêu. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu trước đây của
nhóm tác giả ở Iran khi sử dụng Realtime-PCR để phát hiện gen cp4-epsps, khi nhận thấy rằng
giới hạn phát hiện của Realtime-PCR đối với gen mục tiêu ở mức 0,4 ng/ µL [22]. Như vậy,
đối với cùng lượng DNA mẫu, phản ứng LAMP có độ nhạy trong việc khuếch đại đoạn DNA
đặc trưng tốt hơn phản ứng Realtime PCR. Qua thí nghiệm này có thể kết luận rằng phương
pháp LAMP có độ nhạy cao hơn Realtime PCR ít nhất 16 lần. Ngoài ra, nghiên cứu trước đó
của Nkouawa và cộng sự cũng đã khẳng định kỹ thuật LAMP có độ nhạy tốt hơn phương pháp
PCR truyền thống [12]. Điều này có thể giúp cho phản ứng LAMP có thể được sử dụng đối
với các mẫu phân tích có nồng độ DNA mục tiêu thấp.
3.4. Phát hiện trực tiếp sản phẩm LAMP
Với mục đích cuối cùng là có thể phát hiện ngô biến đổi gen qua quan sát trực tiếp bằng
mắt thường, thuốc nhuộm HNB (hydroxyl-naphthol-blue, Sigma, Mỹ) được sử dụng để thay
thế SYBR. Kết quả cho thấy ở các sản phản ứng có DNA của ngô biến đổi gen, sản phẩm phản
ứng ở ngô chuyển gen hơi ngả sang màu xanh lục, trong khi đó ngô thường có màu xanh dương
và được thể hiện như ở Hình 4. Sự khác biệt này tăng dần khi tăng nồng độ thuốc nhuộm và
thể hiện rõ nhất ở nồng độ 80 mM. Khi tăng nồng độ thuốc nhuộm HNB lên 160 mM, việc
phân biệt giữa 2 phản ứng không còn hiệu quả do màu sắc trở nên gần giống nhau. Trong khi
đó, những nghiên cứu trước đây cho thấy nồng độ phù hợp để phân biệt rõ ràng các mẫu nằm
ở mức cao hơn [19, 20].
Hình 4. Kết quả phát hiện ngô chuyển gen Cry1Ab trực tiếp bằng LAMP sử dụng thuốc nhuộm
HNA ở các nồng độ 20 µM (A), 40 µM (B), 80 µM (C), và 160 µM (D).
(T: ngô thường; CG: ngô chuyển gen).
Mặc dù còn hạn chế, kết quả ban đầu cho thấy khả năng sử dụng thuốc nhuộm HNB có
khả năng phát hiện trực tiếp sản phẩm khuếch đại của kỹ thuật LAMP. Kết quả này có tiềm
năng trong việc áp dụng trực tiếp ngoài thực tế vì không bị phụ thuộc vào các thiết bị phòng
thí nghiệm như hệ thống điện di, hệ thống chụp gel. Ngoài ra, nó cũng giúp góp phần rút ngắn
thời gian thực hiện thông qua việc giảm các bước điện di và chụp hình. Đây là một trong những
ưu điểm rất lớn của kỹ thuật LAMP đã được đề cập ở các nghiên cứu trước.
4. KẾT LUẬN
Kết quả nghiên cứu này đã hoàn thiện được quy trình phát hiện ngô biến đổi gen thông
qua xác định sự có mặt của gen Cry1Ab bằng kỹ thuật LAMP với các thông số tối ưu: nồng
độ, nhiệt độ và ngưỡng khuếch đại. Cuối cùng, khả năng phát hiện trực tiếp sản phẩm khuếch
đại của LAMP được hoàn thành bằng cách sử dụng thuốc nhuộm HNB. Bên cạnh những kết
quả nghiên cứu đã đạt được, cần có các nghiên cứu khác có thể thực hiện trong tương lai để
góp phần hoàn thiện hơn bao gồm: chọn được thuộc nhuộm phù hợp và có độ phân biệt cao.
42
Xây dựng quy trình phát hiện nhanh ngô chứa gen Cry1Ab dựa trên kỹ thuật LAMP
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Tạ Bá Hưng, Cao Minh Kiểm, Đặng Bảo Hà, Nguyễn Mạnh Quân, Nguyễn Phương Anh,
Phùng Anh Tiến - Quản lý thực phẩm biến đổi gen: Kinh nghiệm của Mỹ, Liên minh
Châu Âu và Trung Quốc, Cục Thông tin Khoa học và Công nghệ Quốc gia (2010) 9-12.
2. ISAAA - Pocket K No.16: Biotech Crop Highlights in 2018:
3. Nguyễn Tiến Dũng - Chính thức công nhận 3 giống ngô biến đổi gen, Báo Công
4. Chen L., Guo J., Wang Q., Kai G., and Yang L. - Development of the visual loop-
mediated isothermal amplification assays for seven genetically modified maize events
and their application in practical samples analysis, Journal of Agricultural and Food
Chemistry 59 (11) (2011) 5914-5918.
5. Trung tâm Thông tin và Phát triển Nông nghiệp Nông thôn - Tràn ngập nông sản biến
6. Nguyễn Đình Hòe, Nguyễn Ngọc Sinh - Những vấn đề của sinh vật biến đổi gen - GMO,
Hội bảo vệ thiên nhiên và môi trường Việt Nam, truy cập ngày 14/8/2012 tại
7. Randhawa G.J., Firke P.K. - Detection of transgenes in gentically modified soybean
and maize using polymerase chain reaction, Indian Journal of Biotechnology 5 (2006)
510-513.
8. Meric S., Cakir O., Turgut-Kara N., and Ari S. - Detection of genetically modified
maize and soybean in feed samples, Gentics and Molecular Research 13 (1) (2014)
1160-1168.
9. Notomi T., Okayama H., Masubuchi H., Yonekawa T., Watanabe K., Amino N., and
Hase T. - Loop-mediated isothermal aplification of DNA, Nucleic Acids Research 28
(12) (2000) e63.
10. Randhawa G.J., Singh M., Morisset D., Sood P., Zel J. - Loop-mediated isothermal
amplification: rapid visua and realtime method for detection of genetically modified
crops, Journal of Agricultural and Food Chemistry 61 (47) (2013) 11338-11346.
11. Hoàng Phú Hiệp, Lê Quang Huấn - Phát triển kỹ thuật LAMP cho việc phát hiện nhanh
và chính xác Escherichia coli O157:H7, Tạp chí Sinh học 34 (3) (2012) 343-346.
12. Nkouawa A., Sako Y., Nakao M., Nakaya K., Ito A. - Loop-mediated isothermal
amplification method for differentiation and rapid detection of Taenia species, Journal
of Clinical Microbiology 47 (1) (2009)168-174.
13. Bùi Minh Trí, Bùi Cách Tuyến - Xây dựng quy trình chẩn đoán ngô có chuyển các gen
kháng sâu (CryIA [b]) và gen tăng cường chuyển hóa đường (Invertase) bằng kỹ thuật
PCR, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Nông Lâm nghiệp, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí
Minh, Số 1 (2003) 3-7.
14. Xu W.T., Cao S., Xiaoyun H., Luo Y., Guo X., Yuan Y., and Huang K. - Safety
assessment of Cry1Ab/Ac fusion protein, Food and Chemical Toxicology 47 (7) (2009)
1459-1465.
43
Hồ Viết Thế, Trần Thị Mỹ Hạnh, Nguyễn Thị An, Ngô Thị Kim Anh, Nguyễn Thị Hương...
15. Rahman T., Chowdhury E., Mondol A., Hoque M., Nasiruddin K. - Detection of maize
intrinsic and recombinant Cry1ab gene fragment in genetically modified maize, Plant
Tissue Culture and Biotechnology 17 (1) (2007) 103-108.
16. Zhou X., Xing D., Tang Y., and Chen W.R. - PCR-free detection of genetically modified
organisms using magnetic capture technology and fluorescence cross-correlation
spectroscopy, PLoS One 4 (2009) e8074.
17. Zhen Z., Zhang M., Yu Y., Gao X., Zhu Y., Yan Y., Zhang R. - Establishment of a
loop-mediated isothermal amplification (LAMP) detection method for gentically
modified maize MON88017, European Food Research and Technology 242 (10) (2016)
1787-1793.
18. Zahradnik C., Kolm C., Martzy R., Mach R.L., Krska R., Farnleitner A.H., Brunner K.
- Detection of the 35S promoter in transgenic maize via various isothermal
amplification techniques: a practical approach, Analytical and Bioanalytical Chemistry
406 (27) (2014) 6835-6842.
19. Nair S., Manimekalai R., Raj P.G., Hegde V. - Loop mediated isothermal amplification
(LAMP) assay for detection of coconut root wilt disease and arecanut yeallow leaf disease
phyoplasma, World Journal of Micorbiology and Biotechnology 32 (7) (2016) 108.
20. Goto M., Honda E., Ogura A., Nomoto A., and Hanaki K.I. - Colorimetric detection of
loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxyl naphthol blue,
Biotechniques 46 (3) (2009) 167-172.
21. Ghosh R., Nagavardhini A., Sengupta A., and Sharma M. –Development of loop- mediated
Isothermal Amplification (LAMP) assay for rapid detection of Fusarium oxysporum f. sp.
ciceris-wilt pathogen of chickpea, BMC Ressearch Notes 8 (40) (2015) 1-10.
22. Khosravi S., Tohidfar M., and Koobaz P. –Development of Gene-Specific Realtime-
PCR screening method for detection of cp4-epsps gene in GM crops, BioRxiv (2017),
23. VFC - Ba giống ngô biến đổi gen đầu tiên tại Việt Nam, truy cập ngày 06/04/2015 tại
ABSTRACT
DEVELOPING METHOD FOR QUICK IDENTIFICATION OF Cry1Ab- GENETICALLY
MODIFIED MAIZE BASED ON LAMP TECHNIQUE
Ho Viet The1,*, Tran Thi My Hanh2, Nguyen Thi An1,
Ngo Thi Kim Anh1, Nguyen Thi Huong1, Le Ngoc Giau1
1Ho Chi Minh City University of Food Industry
2Ho Chi Minh City University of Technology (HUTECH)
*Email: thehv@hufi.edu.vn
Vietnam has allowed the cultivation of gentically modified maize containing Cry1Ab
gene to increase resistance to stem borer. Despite many advantages, there are still many
debates about the safety of this crop so there are many methods used to detect them. However,
the current methods rely heavily on laboratory equipment and are difficult to perform in the
field. Recently, the LAMP (Loop Mediated Isothermal Amplification) DNA amplification
technique has been used to quickly detect human and animal disease objects, with high
44
Xây dựng quy trình phát hiện nhanh ngô chứa gen Cry1Ab dựa trên kỹ thuật LAMP
accuracy and less requirements for expensive equipment. Within the scope of this study, we
have successfully developed a process to detect gentically modified maize using LAMP
technology. The results of the study have optimized parameters for LAMP reaction including
concentration of FIP/BIP and F3/B3 of 0.4 µM with primer pairing temperature at 60 °C. The
authors also found that the sensitivity of LAMP reaction was better than that of Realtime PCR
in studied range. When using HNB dye at a concentration of 80 nM, it was possible to
distinguish between the non-transgenic and Cry1ab gene containing maize. This result is a
potential for designing KIT to detect gentically modified corn in the field.
Keywords: Corn, Cry1Ab, GMO, LAMP, Realtime PCR.
45
9 trang
09/01/2024
360
Bạn đang xem tài liệu "Xây dựng quy trình phát hiện nhanh ngô chứa gen CRY1AB dựa trên kỹ thuật LAMP", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên
File đính kèm:
- xay_dung_quy_trinh_phat_hien_nhanh_ngo_chua_gen_cry1ab_dua_t.pdf
