Nghiên cứu xác định đoạn ADN mã vạch cho dây thìa canh (Gymnema sylvestre (retz.) r.br) phục vụ giám định loài
Công nghệ sinh học & Giống cây trồng
NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐOẠN ADN MÃ VẠCH CHO DÂY THÌA CANH
(Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br) PHỤC VỤ GIÁM ĐỊNH LOÀI
Nguyễn Văn Việt1, Nguyễn Thị Huyền1, Đào Thị Thúy Hằng2
1Trường Đại học Lâm nghiệp
2Bệnh viện Y học cổ truyền, Bộ Công an
TÓM TẮT
Việt Nam là quốc gia có nguồn tài nguyên đa dạng và phong phú với rất nhiều loài động vật, thực vật và nấm
có giá trị kinh tế cao. Trước đây, các phương pháp định danh và phân loại thực vật chủ yếu dựa vào hình thái
giải phẫu sinh học. Tuy nhiên, việc dựa vào hình thái để phân loại gặp nhiều khó khăn, đặc biệt là tốn kém về
mặt thời gian, công sức và kinh phí. Hiện nay, phương pháp định danh loài sử dụng các chỉ thị phân tử ADN
được ứng dụng rộng rãi. Trong đó, ADN mã vạch được xem là phương pháp hiện đại và chính xác để định
danh các loài sinh vật khi sử dụng những vùng ADN cả ở trong nhân, ty thể và lạp thể. Trong nghiên cứu
này, phương pháp ADN mã vạch (DNA barcoding) đã được thử nghiệm cho nhận dạng loài Dây thìa canh
(Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br). Ba mã vạch ADN được đề xuất cho nghiên cứu thuộc vùng ADN lục lạp
và ADN nhân (psbA-trnH, trnL và ITS1). Tỷ lệ thành công cho khuyếch đại PCR cho ba đoạn mã vạch là
100%. Tỷ lệ Giải trình tự nucleotide thành công cả hai chiều của sản phẩm PCR là 100% với kích thước lần
lượt là 565 bp, 567 bp và 767 bp cho psbA-trnH, trnL và ITS1. Phân tích BLAST và ClustalW2 chỉ ra khả
năng phân biệt ở mức độ loài của ba đoạn mã vạch đề xuất là: psbA-trnH > ITS1 > trnL. Cuối cùng, sự tổ
hợp hai mã vạch psbA-trnH và ITS1 được lựa chọn cho nhận dạng loài Dây thìa canh.
Từ khóa: Dây thìa canh, giám định loài, ITS1, mã vạch ADN, psbA-trnH, trnL.
Taberlet và cộng sự, 2007; Lahaye và cộng
sự, 2008; Ford và cộng sự, 2009; Nguyễn Văn
Việt và cộng sự, 2016).
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam là quốc gia có nguồn tài nguyên
đa dạng và phong phú với rất nhiều loài động
vật, thực vật và nấm có giá trị kinh tế cao.
Trong đó, giới thực vật có tính đa dạng rất cao
về loài. Đến nay có 350.000 loài thực vật đã
được định dạng. Trước đây, các phương pháp
định danh và phân loại thực vật chủ yếu dựa
vào hình thái sinh học là chính. Tuy nhiên
việc dựa vào hình thái để phân loại gặp nhiều
khó khăn như: Các giai đoạn phát triển của
thực vật khác nhau, thu mẫu rời rạc hay
những mẫu vật không nguyên vẹn dẫn đến
những khó khăn nhất định trong công tác phân
loại đặc biệt là tốn kém về mặt thời gian, công
sức, kinh phí...
Dây thìa canh là một trong những cây thuốc
có giá trị kinh tế cao, sản phẩm từ các bộ phận
lá, thân, rễ của Dây thìa canh được dùng trong
y dược có tác dụng giảm cholesterol, hạ lipid
và đường huyết trong máu; phòng chống xơ
vữa động mạch và những tai biến nguy hại do
tiểu đường gây ra (Đỗ Tất Lợi, 2012). Tuy
nhiên, hiện nay với nhu cầu sử dụng dược liệu
có nguồn gốc từ thiên nhiên ngày càng cao thì
việc định danh và truy xuất nguồn gốc của
dược liệu ngày càng cấp thiết, đặc biệt là
những loài cây dược liệu quý, có giá trị sử
dụng lớn như Dây thìa canh.
DNA barcoding là một phương pháp định
danh và giám định loài dựa trên các trình tự
ADN ngắn ở những vùng chuẩn hóa của ADN
hệ gen (Hebert và cộng sự, 2003). Ở thực vật,
việc nghiên cứu truy tìm những vùng ADN hệ
gen thích hợp được chứng minh là thách thức
hơn so với động vật. Một vài vùng trong bộ
gen lục lạp (Ví dụ như: trnL, rpoC1, rpoB,
ycf5, psbA-trnH, trnL, atpF-atpH, psbK-psbI)
cũng như vùng đệm trong được sao chép
(internal transcribed spacer - ITS) của ADN
ribosome nhân đã nổi lên như là ứng viên tốt
nhất cho mã vạch ADN thực vật (Chase và
cộng sự, 2005; Kress và cộng sự, 2005; Shaw
và cộng sự, 2007; Kress và cộng sự, 2007;
Trong bài báo này, phương pháp ADN mã
vạch (DNA barcoding) đã được thử nghiệm
cho nhận dạng Dây thìa canh. Ba mã vạch
ADN được đề xuất cho nghiên cứu thuộc
vùng ADN lục lạp (trnLvà psbA-trnH) và
ADN nhân (ITS1). Những mã vạch này đã
được chứng minh là có khả năng nhận dạng
cao giữa các loài và biến thể thấp trong loài
(Chen và cộng sự, 2010; Pang và cộng sự,
2012). Mục đích của nghiên cứu này là đưa ra
được một mã vạch ADN đặc trưng cho việc
nhận dạng loài Thìa canh nêu trên.
2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Lựa chọn và cách lấy mẫu
Chọn 15 mẫu lá tươi từ 5 cá thể Dây thìa
TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 1 - 2020
25
Công nghệ sinh học & Giống cây trồng
canh được thu thập tại Trại giam Suối Hai, Ba
Vì, Hà Nội. Kí hiệu là TC1, TC2, TC3, TC4,
TC5. Mẫu lá tươi ngay sau đó được cho vào
túi Ziplock chứa silicagel và chuyển về phòng
thí nghiệm lưu trữ ở -800C cho đến khi ADN
được tách chiết. Tất cả các mẫu lá thu thập
cho mục đích nghiên cứu đã được định danh
cùng các tiêu bản mẫu cây chuẩn hóa.
2.2. Phương pháp tách chiết ADN hệ gen
ADN hệ gen được tách chiết theo phương
pháp CTAB (Cetyl trimethyl ammonium
bromide) của Saghai Maroof và cộng sự
(1984) với một sự thay đổi nhỏ. Khoảng 100
mg mô lá được nghiền trong cối bằng chày sứ
trong 600 ml đệm CTAB (4% CTAB thay vì
2%, 20 mM EDTA, 1,4 M NaCl, 1% beta-
mercaptoethanol, 100 mM Tris-HCl pH 8.0).
Mẫu được chuyển vào ống ly tâm 1,5 ml và ủ
ở 650C trong bể ổn nhiệt 30 phút, sau đó được
chiết xuất cùng với một thể tích chloroform.
Các mẫu được ly tâm ở 10.000 vòng/phút,
trong 15 phút. Pha trên của dung dịch được
chuyển sang ống ly tâm 1,5 ml mới. ADN
được kết tủa bằng cách thêm 500 l
isopropanol lạnh và ly tâm ở 10.000
vòng/phút, trong 15 phút. ADN kết tủa sau đó
được rửa sạch bằng cồn 70%. Làm khô và hòa
tan ADN trong 100 l đệm TE.
2.3. Phương pháp khuyếch đại PCR và đọc
trình tự
Ba chuỗi ADN mã vạch là ITS1, trnL và
psbA-trnH được khuyếch đại bằng máy PCR
9700 Thermal Cycler Applied Biosystems
(Mỹ). Hỗn hợp phản ứng PCR (25l) gồm:
2,5 μl đệm 10X Taq, 2,0 μl hỗn hợp dNTP
(2,0 mM), 1,0 μl cho mỗi cặp mồi (10 μM),
0,5 μl cho 5 U/μl Taq DNA polymerase, 1 μl
ADN khuôn (50 ng/μl) và H20 cho tổng thể
tích đạt là 25 l. Chu kỳ nhiệt cho PCR: 950C
trong 3 phút; (950C: 30 giây, 570C - 620C: 30
giây, 720C: 1 phút) lặp lại 40 chu kỳ; 720C
trong 7 phút; bảo quản sản phẩm PCR ở 40C.
Sản phẩm PCR được được di trên gel agarose
1%. Trình tự nucleotide của mồi cho ba vùng
ADN được thể hiện ở bảng 1. Sản phẩm PCR
được tinh sạch bằng bộ Kit của hãng Norgen
biotek, Canada. Trình tự nucleotide được đọc
trên máy ABI PRISM®3730xl DNA Analyzer
(ABI, Foster City, CA, USA).
Bảng 1. Danh sách và trình tự nucleotide của các cặp mồi
Kích thước
theo lý thuyết
Kí hiệu
mồi
Nhiệt độ
Gen
Trình tự mồi (5’-3’)
gắn mồi (0C)
GGGTTCAAACGCTCGCCTCGA
AGAATCGGGCGGCTCCGCCG
P12F
P12R
P10F
P10R
P11F
P11R
ITS1
700 bp
450 bp
570 bp
58
56
58
GGAAATTATGAGCATTAGTGAATCAC
GCATTACGTTCATTGCATAAACA
CTTGCACCCCTTCTATCCCCATCTA
psbA-
trnH
trnL
TCCGTAGCGTCAACCCGATTTCGA
đã chứng tỏ là một quy trình có hiệu quả để
phân lập ADN thực vật. Cách tiếp cận này là
phổ biến đối với chiết xuất ADN từ các loài
thực vật có chứa hàm lượng cao
polysaccharide, cũng như các hợp chất
polyphenol, tannin, flavonoid (Ghaffariyan và
cộng sự, 2012). Trong nghiên cứu này, ADN
cũng được chiết xuất thành công từ tất cả các
mẫu nghiên cứu (Hình 1). Băng ADN thu
được tương đối gọn, tập trung phía trên đầu
giếng và cũng không xuất hiện vệt sáng trong
giếng của bản gel agarose 1%. Những đặc
điểm này chứng minh rằng ADN tổng số thu
được có kích thước lớn, không lẫn protein, đủ
2.4. Phương pháp phân tích dữ liệu ADN
mã vạch (DNA barcode)
Trình tự nucleotide của các đoạn ADN mã
vạch thu được xử lý bằng các phần mềm
Bioedit version 7.2.5, Clustal X 1.83 và công
cụ BLAST (Bagic local Alignment Search
Tool) trên NCBI (National Center for
Biotechnology Information) tại địa chỉ
website:
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số
ADN được tách chiết theo phương pháp
CTAB của Saghai Maroof và cộng sự (1984)
26
TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 1 - 2020
Công nghệ sinh học & Giống cây trồng
điều kiện làm ADN khuôn cho nhân bản ba
đoạn mã vạch ADN đề xuất, đặc biệt khi tất
cả các đoạn ADN mã vạch này đều nằm ở 2
vùng ADN lục lạp và 1 vùng ADN nhân.
Hình 1. Kết quả điện di ADN tổng số của 5 mẫu Dây thìa canh
Ghi chú: Giếng từ 1 – 5: mẫu TC1 – TC5
3.2. Kết quả nhân gen với các đoạn ADN 3.2.1. Kết quả nhân gen psbA-trnH bằng kĩ
mã vạch bằng kĩ thuật PCR
thuật PCR
Đoạn psbA-trnH có kích thước trung bình
Từ 5 mẫu ADN tổng số đã tách được, sử
dụng cặp mồi đặc hiệu cho từng đoạn để tiến khoảng 450 bp theo lý thuyết, nhưng trên thực
hành PCR nhân bản các đoạn ADN. Mẫu tế có thể thay đổi từ 296 - 1120 bp tùy thuộc
ADN tổng số được pha loãng 10 lần (điều loài. psbA - trnH có khả năng xác định loài
chỉnh nồng độ ADN đạt 50 ng/µl). Sau khi cao. Locus psbA - trnH đã được khuếch đại
điều chỉnh nồng độ ADN phù hợp, tiến hành thành công ở nhiều thực vật hạt kín và hạt trần.
nhân bản 3 đoạn gen psbA- trnH, trnL và Tuy nhiên, trong nhiều thực vật hạt kín psbA -
ITS1 từ ADN tổng số của 5 mẫu Dây thìa trnH lại có kích thước rất ngắn. Kích thước
canh bằng phản ứng PCR với các cặp mồi của gen này khá lớn do có mặt của gen rps19
tương ứng lần lượt là: psbA - trnH-P10F và hoặc các gen giả nằm giữa cùng gen của hai
psbA - trnH-P10R; trnL - P11F và trnL - gen psbA và trnH. Trong thí nghiệm này,
P11R; ITS1 - P12F và ITS1 - P12R. Thực hiện ADN tách chiết được làm khuôn để nhân bản
phản ứng PCR lặp lại 3 lần trên mỗi mẫu thí đoạn gen psbA - trnH bằng phương pháp PCR
nghiệm. Sản phẩm PCR của tất cả các mẫu với cặp mồi đặc hiệu với trình tự mồi được nêu
thí nghiệm được kiểm tra bằng điện di trên ở bảng 1. Kết quả PCR cho thấy đoạn băng
gel agarose 1%. Kết quả điện di sản phẩm sáng rõ và đồng đều, không xuất hiện băng
PCR từ 5 mẫu Dây thìa canh được thể hiện phụ. Kích thước khoảng 500 bp, đủ điều kiện
trên hình 2, 3 và 4.
để tiến hành xác định trình tự nucleotide.
Hình 2. Kết quả nhân đoạn gen psbA-trnH từ các mẫu Dây thìa canh bằng mồi P10
Ghi chú: M: marker 1000bp; giếng từ 1 – 5: mẫu TC1 – TC5
nữa khẳng định chất lượng và kích thước đủ
3.2.2. Kết quả nhân gen trnL bằng kĩ thuật PCR
Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy, lớn cũng như không lẫn các tạp chất
đoạn gen trnL khuếch đại thành công ở tất cả (polysacarit, phenol) gây ảnh hưởng đến nhân
các mẫu. Ở các mẫu đều thu được một băng dòng PCR, điều đó cho thấy sản phẩm PCR
ADN sáng rõ nét, không có băng ADN phụ nhân bản đoạn gen trnL rất đặc hiệu, có thể sử
xuất hiện, kích thước khoảng 500 - 550 bp phù dụng trực tiếp sản phẩm này để xác định trình
hợp với kích thước lý thuyết của đoạn gen tự nucleotide.
trnL dự kiến nhân bản. Kết quả này một lần
TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 1 - 2020
27
Công nghệ sinh học & Giống cây trồng
Hình 3. Kết quả nhân đoạn gen trnL từ các mẫu Dây thìa canh bằng mồi P11
Ghi chú: M: marker 1000bp; giếng từ 1 - 5: mẫu TC1 - TC5
các mẫu. Các mẫu đều thu được một băng
3.2.3. Kết quả nhân bản gen ITS1 bằng kĩ
thuật PCR
Kết quả nhân bản gen ITS1 bằng kĩ thuật
PCR với cặp mồi đặc hiệu như mô tả ở bảng
1, được thể hiện ở hình 4. Qua hình 4 cho thấy
đoạn gen ITS1 khuếch đại thành công ở tất cả
ADN sáng rõ nét, không có băng ADN phụ
xuất hiện, kích thước khoảng 700 - 750 bp
phù hợp với kích thước lý thuyết của đoạn gen
ITS1 dự kiến nhân bản.
Hình 4. Kết quả nhân đoạn gen ITS1 từ các mẫu Dây thìa canh dùng mồi P12
Ghi chú: M: marker 1000 bp; giếng từ 1 - 5: mẫu TC1 - TC5
Thành công của khuyếch đại PCR cùng xác
ba đoạn mã vạch ở tất cả các mẫu nghiên cứu
chứng tỏ sự hiệu quả trong tối ưu hóa thiết kế
mồi và quy trình PCR.
3.3. Phân tích trình tự các đoạn ADN mã
vạch với các đoạn mồi khác nhau
định được trình tự là một tiêu chí quan trọng
để đánh giá tính hữu ích của ADN mã vạch.
Trong nghiên cứu này, ba đoạn mã vạch đề
xuất psbA-trnH, trnL và ITS1 được khuyếch
đại bằng việc sử dụng các cặp mồi phổ quát
cùng các thành phần và quy trình PCR được
tối ưu hóa cho từng đoạn mã vạch. Tất cả các
đoạn ADN mã vạch trên đều được khuyếch
đại thành công ở tất cả 5 mẫu nghiên cứu
(Hình 2, 3 và 4). Tỷ lệ thành công cho
khuyếch đại PCR cho ba đoạn mã vạch là
100%. Tỷ lệ giải trình tự thành công cả hai
chiều sản phẩm PCR đạt được là 100% cho ba
đoạn ADN mã vạch. Kết quả này một lần nữa
khẳng định số lượng và chất lượng của ADN
được tách chiết từ mẫu ban đầu để làm khuôn
cho phản ứng nhân dòng gen bằng kĩ thuật
PCR rất quan trọng và ảnh hưởng trực tiếp
đến thành công của các thí nghiệm phía sau.
Cùng với đó, sản phẩm PCR đặc hiệu của cả
Với cách lựa chọn 5 mẫu Dây thìa canh
cùng ba lần lặp lại ở mỗi mẫu, tổng cộng thu
được 15 trình tự nucleotide cho một đoạn
ADN mã vạch đề xuất. Chất lượng trình tự
nucleotide là cao ở tất cả các mẫu, tỷ lệ đọc
thành công là 100%. Các trình tự này sau đó
được chỉnh sửa và ghép nối bằng tay và phần
mềm Bioedit version 7.2.5. Kết quả trình tự
nucleotide phân tích thuộc 3 vùng ADN là
565 bp, 567 bp và 767 bp cho 3 gen psbA -
trnH, trnL và ITS1 (Bảng 2). Tiếp theo, trình
tự nucleotide của từng đoạn mã vạch được so
sánh trực tiếp với cùng loại ADN mã vạch ở
cùng loài Dây thìa canh (Gymnema sylvestre)
hoặc cùng chi Gymnema trên cơ sở dữ liệu
ADN mã vạch (BOLD-Barcode of Life Data
28
TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 1 - 2020
Công nghệ sinh học & Giống cây trồng
Systems), Trung tâm thông tin Công nghệ
sinh học Hoa Kỳ (NCBI-National Center for
Biotechnology Information) bằng công cụ
BLAST (Có sẵn tài địa chỉ website:
https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) và phần
mềm ClustalW2 (Có sẵn tại địa chỉ
website:http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/).
Bảng 2. Đánh giá ba vùng ADN đề xuất
Các mã số trình tự
psbA-
trnH
TT
Chỉ tiêu phân tích
trnL
ITS1
nucleotide trên GenBank
được lựa chọn để so sánh
MF064896.1; MF064897.1;
MF064898.1; HE805512.1,
HG530575.1, AJ402142.2,
KE953920.1, AJ402137.1,
AJ431750.1; MF409652.1,
MG730191.1, MG730189.1,
MG730190.1, MG818139.1,
MF063778.1, MF063777.1
1
2
3
4
5
Tỷ lệ PCR thành công (%)
Tỷ lệ đọc trình tự thành công (%)
Chiều dài trình tự (bp)
Vị trí sai khác
100
100
565
319
1
100
100
567
201
1
100
100
767
376
1
Số nucleotide sai khác
6
Sự phân biệt mức độ loài (%)
0,18
0,18
0,13
chính xác sự sai khác nằm tại các vị trí nào,
bằng phần mềm Bioedit, trình tự nucleotide
của psbA-trnH từ loài Dây thìa canh được so
sánh với cùng loại mã vạch psbA - trnH mã số
MF064898.1. Điểm bắt đầu so sánh ở vị trí
nucleotide thứ 1, kết quả chỉ ra 1 nucleotide
sai khác (Bảng 2, hình 5).Trong đó 1 vị trí
(Nucleotide thứ 319 thay T bằng A).
3.3.1. Kết quả phân tích trình tự nucleotide
của đoạn gen psbA-trnH
Với đoạn mã vạch psbA-trnH, hiện chi
Gymnema có
3
trình tự trên NCBI:
MF064896.1; MF064897.1; MF064898.1 đều
cùng loài Gymnema sylvestre, trong đó trình tự
có mã số MF064898.1 cho thấy độ tương
đồng cao nhất đến hơn 99%. Do đó, để biết
Hình 5. Vị trí nucleotide sai khác so sánh trên vùng psbA-trnH
Ghi chú: vị trí sai khác là vị trí khoanh tròn
NCBI:
AJ402142.2,
HE805512.1,
KE953920.1,
HG530575.1,
AJ402137.1,
3.3.2. Kết quả phân tích trình tự nucleotide
của đoạn gen trnL
Với đoạn mã vạch trnL, có 6 trình tự trên
AJ431750.1. So sánh trình tự nucleotide của
TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 1 - 2020
29
Công nghệ sinh học & Giống cây trồng
trnL của Dây thìa canh được so sánh với mã
vạch trnL mã số KE953920.1 của 1 loài thuộc
chi Gymnema, kết quả chỉ ra 1 nucleotide sai
khác (Bảng 2, hình 6), trong đó 1 vị trí
(Nucleotide thứ 201 thay T bằng A).
Hình 6. Vị trí nucleotide sai khác so sánh trên vùng trnL
Ghi chú: vị trí sai khác là vị trí khoanh tròn
sánh trình tự nucleotide của ITS1 của Dây thìa
3.3.3. Kết quả phân tích trình tự nucleotide
của đoạn gen ITS1
canh được so sánh với mã vạch ITS1 mã số
MG730191.1 của một loài thuộc chi
Gymnema, kết quả chỉ ra 1 nucleotide sai khác
(Bảng 2, hình 7), trong đó 1 vị trí (Nucleotide
thứ 376 thay C bằng G).
Cũng như thế, với đoạn mã vạch ITS1, có 7
trình
tự
trên
NCBI:
MF409652.1,
MG730191.1, MG730189.1, MG730190.1,
MG818139.1, MF063778.1, MF063777.1.So
Hình 7. Vị trí nucleotide sai khác so sánh trên vùng ITS1
Ghi chú: vị trí sai khác là vị trí khoanh tròn
30
TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 1 - 2020
Công nghệ sinh học & Giống cây trồng
Như vậy, với ba vùng ADN được lựa chọn
là psbA-trnH, trnL và ITS1 đại diện cho sự
tiến hóa dẫn đến sai khác nucleotide đủ để
đảm bảo cho sự phân định loài. Kết quả phân
tích từ ba vùng trên đều cho sự khác biệt
nucleotide giữa hai hệ gen nghiên cứu là
không nhiều nên có thể sử dụng 3 trình tự
thuộc ba vùng gen trên làm cơ sở cho giám
định loài.
(Bảng 3b) với mã số KF953920.1 (Gymnema
sylvestre). Điều này cho thấy hai trình tự này
có quan hệ họ hàng rất gần gũi với nhau, và
sự sai khác có thể được lý giải là do nguồn
gốc xuất xứ của các mẫu nghiên cứu không
giống nhau. Từ kết quả hệ số khác biệt di
truyền thu được như bảng 3b, dùng phần mềm
MEGA 6 và phương pháp Neighbor - Joining
vẽ cây phát sinh chủng loại.
So sánh của trình tự gen trnL của một số
loài có trình tự tương đồng trên ngân hàng gen
NCBI bằng cách sử dụng công cụ BLAST,
chúng tôi đã thiết lập được cây phát sinh
chủng loại nhờ NCBI (Ngân hàng gen). So
sánh trình tự mã gen của trnL của Dây thìa
canh có mã gen trnL có độ tương đồng cao
99,27% với mã vạch KF953920.1 (Hình 8b).
3.4.3. Cây phát sinh chủng loại dựa vào
trình tự trên đoạn ITS1
Xây dựng cây phát sinh thể hiện mối quan
hệ di truyền của loài Dây thìa canh nghiên
cứu với một số loài thuộc chi Gymnema trên
ngân hàng gen NCBI. Đối với trình tự gen
ITS1 cây phát sinh được xây dựng với chi
Gymnema trên ngân hàng gen NCBI có 7 trình
tự: MG730190.1; MF063778.1; MG730189.1;
MF409652.1; MG818139.1; MF063777.1;
MG730191.1 đều của loài Gymnema
sylvestre. Qua đây có thể thấy rằng ITS1 là
một vùng có sự biến thiên nucleotide rất lớn
và đã được chứng minh là có hiệu quả trong
việc đánh giá mối quan hệ phát sinh giữa các
loài thực vật. Kết quả thu được trong nghiên
cứu này cho thấy mã vạch ITS1 có sự tương
đồng đến 100% với trình tự có mã số
MG818139.1 (Bảng 3c).
Từ kết quả hệ số khác biệt di truyền thu
được như bảng 3c, dùng phần mềm MEGA 6
và phương pháp Neighbor - Joining xây dựng
cây phát sinh chủng loại. Tiếp tục so sánh
trình tự gen ITS1 của một số loài có trình tự
tương đồng trên ngân hàng gen NCBI bằng
cách sử dụng công cụ BLAST, chúng tôi đã
thiết lập được cây phát sinh chủng loại nhờ
NCBI (Ngân hàng gen). So sánh trình tự mã
gen ITS1 của Dây thìa canh với mã vạch
MF409652.1 có độ tương đồng đến 99,97%
(Hình 8c).
3.4. Xây dựng cây phát sinh chủng loại
3.4.1. Cây phát sinh chủng loại dựa vào
trình tự trên đoạn psbA-trnH
Dựa vào những kết quả trên, xây dựng cây
phát sinh thể hiện mối quan hệ của loài Dây
thìa canh nghiên cứu với một số loài thuộc chi
Gymnema trên ngân hàng gen NCBI. Đối với
trình tự gen psbA-trnH cây phát sinh được
xây dựng với chi Gymnema trên ngân hàng
gen NCBI có 3 trình tự: MF064898.1;
MF064896.1; MF064897.1. Kết quả phân tích
cho thấy mã vạch psbA-trnH có sự tương
đồng đến hơn 99,99% (Bảng 3a) với trình tự
có mã số MF064898.1. Mặc dù cả 3 trình tự
có mã số MF064898.1; MF064896.1;
MF064897.1 đều của loài Gymnema sylvestre
nhưng do vùng phân bố của loài khá rộng nên
tạo ra những khác biệt di truyền nhất định.
Trong nghiên cứu này cũng cho thấy trình tự
mã vạch psbA-trnH của loài Gymnema
sylvestre (Retz.) R.Br có quan hệ họ hàng gần
gũi với trình tự có mã số MF064898.1. Từ kết
quả hệ số khác biệt di truyền thu được như
bảng 3, dùng phần mềm MEGA 6 và phương
pháp Neighbor-joining vẽ cây phát sinh chủng
loại như hình 8a.
3.4.2. Cây phát sinh chủng loại dựa vào
trình tự trên đoạn trnL
Xây dựng cây phát sinh thể hiện mối quan
hệ của loài Dây thìa canh nghiên cứu với một
số loài thuộc chi Gymnema trên ngân hàng
gen NCBI. Đối với trình tự gen trnL có 6 trình
tự: AJ402137.1 (Gymnema sylvestre);
AJ402142.2
AJ431750.1
HE805512.1
HG530575.1
(Gymnema
(Gymnema
(Gymnema
(Gymnema
sylvestre);
inodorum);
sylvestre);
latifolium);
KF953920.1 (Gymnema sylvestre). Cho thấy
mã vạch trnL có sự tương đồng đến hơn 99%
TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 1 - 2020
31
Công nghệ sinh học & Giống cây trồng
Bảng 3. Hệ số khác biệt di truyền của đoạn psbA-trnH, trnL, ITS1
(a)
(b)
(c)
0.00
0.00
0.00
0.00
MF064898
psbA-trnH
MF064896
MF064897
0.23
0.23
(a)
0.00
0.00
HE805512.1
HG530575.1
AJ402142.2
KF953920.1
trnL
0.00
0.01
0.00
0.35
0.00
0.00
0.00
0.00
0.01
AJ402137.1
AJ431750.1
0.36
(b)
0.04
MF409652.1
ITS
0.01
-0.01
0.02
-0.01
0.06
MG730191.1
MG730189.1
MG730190.1
MG818139.1
MF063778.1
MF063777.1
-0.03
0.07
-0.07
0.16
-0.11
0.00
0.00
0.36
(c)
Hình 8. Cây phát sinh chủng loại dựa vào trình tự trên đoạn psbA-trnH, trnL, ITS1
Ghi chú: Các số thể hiện sự sai khác di truyền giữa hai loài trong cùng nhánh
Tóm lại, với kết quả phân tích BLAST và
ClustalW2 nêu trên, khả năng phân biệt ở mức
độ loài của ba đoạn mã vạch đề xuất là: psbA-
trnH > ITS1 > trnL. Trong đó, hai mã vạch
psbA - trnH và ITS1 cho kết quả với sự khác
biệt rất nhỏ. Kết quả này trùng hợp với
khuyến cáo của CBOL (2009) khi cho rằng
chỉ sử dụng hai mã vạch ADN cho nhận biết
thực vật bậc cao là psbA - trnH và ITS1.
4. KẾT LUẬN
dụng trong nghiên cứu đã được khuyếch đại
và đọc trình tự thành công. Thêm nữa, tiềm
năng nhận biết ở mức độ loài của mã vạch
psbA - trnH và ITS1 là cao hơn trnL dựa trên
phân tích BLAST và ClustalW2. Do đó, sự tổ
hợp hai mã vạch psbA - trnH và ITS1 là phù
hợp để nhận biết loài Dây thìa canh
(Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br).
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Đỗ Tất Lợi (2012). Những cây thuốc và vị thuốc
Việt Nam. NXB Y học.
2. CBoL Plant Working Group (2009). A DNA
barcode for land plants. Proc Natl Acad Sci USA, 106:
12794-12797.
Trong nghiên cứu này, ADN tổng số đã
được tách chiết thành công với một sự thay
đổi nhỏ trong nồng độ CTAB (4% thay vì
2%). Ba đoạn mã vạch CBOL đề xuất được sử
3. Chase M.W, Salamin N, Wilkinson M, Dunwell
32
TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 1 - 2020
Công nghệ sinh học & Giống cây trồng
J.M, Kesanakurthi R.P (2005). Land plants and DNA
barcodes: short-term and long-term goals. Phil Trans
Roy Soc B, 360: 1889-1895.
10. Lahaye R, van der Bank M, Bogarin D, Warner
J, Pupulin F (2008). DNA barcoding the floras of
biodiversity hotspots. Proc Natl Acad Sci USA, 105:
2923-2928.
11. Pang X, Liu C, Shi L, Liu R, Liang D, Li H,
Cherny S. S, Chen S (2012). Utility of the trnH–psbA
intergenic spacer region and its combinations as plant
DNA barcodes: A metaanalysis.PloS One. 7:e48833.
12. Ghaffariyan S, Mohammadi S.A and Aharizad S
(2012). DNA isolation protocol for the medicinal plant
lemon balm (Melissa officinalis). Genetics and
Molecular Research, 11 (2): 1049-1057.
13. Saghai Maroof M. A, Soliman K. M, Jorgensen
R. A, Allard R. W (1984). Ribosomal DNA spacer-
length polymorphism in barley: Mendelian inheritance,
chromosomal location, and population dynamics. Proc
Natl Acad Sci, 81: 8014-8019.
14. Shaw J, Lickey E. B, Schilling E. E, Small R. L
(2007). Comparison of whole chloroplast genome
sequences to choose noncoding regions for
phylogenetic studies in Angiosperms: the tortoise and
the hare III. Am J Bot, 94: 275-288.
4. Chen S, Yao H, Han J, Liu C, Song J, Shi L,
Zhu Y, Ma X, Gao T, Pang X (2010). Validation of the
ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying
medicinal plant species. PloS One. 5:e8613.
5. Ford C. S, Ayres K. L, Toomey N, Haider
N,Alphen S. J (2009). Selection of candidate coding
DNA barcoding regions for use on land plants. Bot J
Linn Soc 159: 1-11.
6. Hebert, P. D, Cywinska A, Ball S. L (2003).
Biological identifications through DNA barcodes.
Proc. R. Soc. Lond. B. Bio, 270: 313-321.
7. Kress W. J, Erickson D. L (2007). A two-locus
global DNA barcode for land plants: the coding trrnL
gene complements the non-coding trnH-psbA spacer
region. PLoS ONE 2: e508.
8. Kress W. J, Wurdack K. J, Zimmer E. A, Weigt
L. A, Janzen D. H (2005). Use of DNA barcodes to
identify flowering plants. Proc Natl Acad Sci USA,
102: 8369-8374.
9. Nguyễn Văn Việt, Sounthone Douangmala,
Phạm Quang Chung, Trần Việt Hà (2016). Thử nghiệm
ba vùng AND lục lạp tiềm năng (matK, trnL và psbA-
trnH) cho nhận dạng loài Gõ đỏ (Afzelia xylocarpa
(Kurz) Craib). Tạp chí Nông nghiệp & Phát triển Nông
thôn, 11: 94-98.
15. Taberlet P, Coissac E, Pompanon F, Gielly L,
Miquel C (2007). Power and limitations of the
chloroplast trnL (UAA) intron for plant DNA
barcoding. Nucl Acids Res 35: e17.
17. http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/)
STUDY ON DNA BARCODES FOR IDENTIFICATION OF
Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br SPECIES
Nguyen Van Viet1, Nguyen Thi Huyen1, Dao Thi Thuy Hang2
1Vietnam National University of Forestry
2Traditional Medicine Hospital, Ministry of Public Security
SUMMARY
Vietnam is a country of diverse and abundant resources with many high economic value animals, plants and
mushrooms species. Previously, the methods of identification and classification of plants were mainly based
on the morphology and anatomy. However, it is difficult to rely on morphology to classify, especially costly
in terms of time, effort and funding. Currently, the method of species identification using DNA molecular
markers is widely used. In particular, DNA barcoding is considered a modern and accurate method for
identifying organisms, using DNA regions both in the nucleus, in mitochondria and in chloroplasts. In plants,
identfication of suitable DNA barcode regions has proven to be more challenging than animals. In this study,
the DNA barcording was approached for identification of Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br species derived
from Suoi Hai, Ba Vi, Ha Noi. Three DNA barcodes (psbA-trnH, trnL và ITS1) proposed in this study belong
to chloroplast DNA and nucleus DNA. The success rates for PCR amplification for these loci were 100%.
The success rate for bidirectional sequencing of PCR products was 100% for all three loci with length 565
bp, 567 bp và 767 bp for psbA - trnH, trnL and ITS1, respectively BLAST and ClustalW2 analysis indicated
the species-specific discriminatory ability of the three proposed bar codes: psbA-trnH > ITS1 > trnL. Finally,
a combination of psbA-trnH and ITS1 barcodes is proposed as a valuable DNA marker for Gymnema
sylvestre (Retz.) R.Br identification.
Keywords: DNA barcode, Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br, identification, ITS1, psbA-trnH, trnL.
Ngày nhận bài
: 08/9/2019
: 26/11/2019
: 05/12/2019
Ngày phản biện
Ngày quyết định đăng
TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 1 - 2020
33
9 trang
09/01/2024
25520
Free
Bạn đang xem tài liệu "Nghiên cứu xác định đoạn ADN mã vạch cho dây thìa canh (Gymnema sylvestre (retz.) r.br) phục vụ giám định loài", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên
File đính kèm:
- nghien_cuu_xac_dinh_doan_adn_ma_vach_cho_day_thia_canh_gymne.pdf
