Nghiên cứu xác định đoạn DNA Barcode cho loài hoàng đàn (Cupressus tonkinensis) phục vụ giám định loài
Công nghệ sinh học & Giống cây trồng
NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐOẠN DNA BARCODE CHO LOÀI
HOÀNG ĐÀN (Cupressus tonkinensis) PHỤC VỤ GIÁM ĐỊNH LOÀI
Hà Văn Huân1, Hoàng Minh Trang1, Bùi Thị Mai Hương1
1Trường Đại học Lâm nghiệp
TÓM TẮT
Hoàng đàn (Cupressus tonkinensis) là các loài cây được đánh giá là có giá trị kinh tế cao, gỗ tốt, gỗ có mùi
hương. Hiện nay các loài này đang bị khai thác khá nhiều. Do đó, loài này đang đối mặt với nguy cơ tuyệt
chủng. Vì vậy, việc xác định các đoạn DNA barcode cho loài Hoàng đàn (Cupressus tonkinensis Silba) phục vụ
giám định loài là cần thiết. ADN tổng số được phân lập từ lá cây Hoàng đàn. Các đoạn DNA barcode (ITS,
rbcL, trnH-psbA and ITS2) được nhân bản từ ADN tổng số của cây Cupressus tonkinensis bằng kỹ thuật PCR.
Sản phẩm PCR chỉ ra rằng các băng thu được có kích thước giống với kích thước dự kiến, sau đó sản phẩm
PCR được xác định trình tự. Kết quả phân tích trình tự đã chỉ ra, đoạn ITS có 1643 nucleotide, đoạn rbcL có
573 nucleotide, đoạn trnH-psbA có 507 nucleotide và đoạn ITS2 có 349 nucleotide. Các trình tự này sau đó được
xử lý trên ngân hàng gen quốc tế NCBI đã tìm ra sự khác biệt với các loài Hoàng đàn khác: đoạn gen ITS tương đồng
94% với loài Cupressus funebris, đoạn gen rbcL tương đồng 97% với loài Cupressus funebris, đoạn gen ITS2 tương
đồng 99% với loài Cupressus funebris, đoạn gen TrnH-psbA tương đồng 99% với loài Cupressus funebris. Sau đó,
chúng tôi đăng ký trên DNABank.vn với mã số: CCT0001; CCT0002; CCT0003; CCT0004. Sử dụng chỉ thị ITS
làm mã vạch ADN để giám định loài Hoàng đàn Cupressus tonkinensis ở Việt Nam.
Từ khóa: Giám định loài, Hoàng đàn, mã vạch ADN.
Việt Nam. Do đó, việc nghiên cứu xác định các
đoạn DNA barcode cho loài Hoàng đàn
(Cupressus tonkinensis Silba) phục vụ giám
định loài là cần thiết và cấp bách cho việc định
danh và bảo tồn loài.
Việc ứng dụng các gen mã vạch, xác định các
đoạn DNA barcode là một phương pháp định
danh, sử dụng một đoạn DNA chuẩn ngắn nằm
trong bộ genome của sinh vật đang nghiên cứu
để phục vụ giám định loài, mang lại hiệu quả cao
trong thời gian ngắn, góp phần không nhỏ vào sự
định danh và bảo tồn các loài thực vật trên thế
giới. Phương pháp xác định các đoạn DNA
barcode là một công cụ hữu hiệu bổ trợ cho
phương pháp phân loại dựa vào hình thái (Aron
J.F. et al., 2008; Kress J.W. et al., 2008).
Ở động vật, đoạn DNA barcode được sử
dụng cho phần lớn các loài là đoạn gen ở ty thể
cytochrome C oxidase (CO1). Ở thực vật, tốc
độ tiến hóa của các đoạn gen ty thể không
nhanh như ở động vật, do đó đoạn CO1 không
được sử dụng. Thay vào đó, một số gen lục lạp
như matK, rbcL; gen vùng nhân như ITS, ITS2;
vùng xen trnH-psbA, psbK-psbI được sử dụng
kết hợp để giám định các loài thực vật (Anders
R., 2012; Alvarez I.W.J.F., 2003; Aron J.F.,
2008; Chase M.W. et al., 2005; Von Crautlein
M.K.H. et al., 2011).
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây Hoàng đàn có tên khoa học là
Cupressus tonkinensis Silba, phân bố hẹp ở các
dải núi đá vôi cao chót vót chạy từ Hữu Lũng,
Chi Lăng, Văn Quan đến Bắc Sơn (Lạng Sơn),
Thạch An (Cao Bằng), Na Hang (Tuyên
Quang), nhưng Hoàng đàn tập trung lớn nhất,
lượng tinh dầu nhiều nhất là ở vùng núi đá vôi
Hữu Lũng (Lạng Sơn). Hoàng đàn là cho gỗ
thẳng, có vân gỗ đẹp, chịu mối mọt, gỗ thường
sử dụng làm đồ thủ công mỹ nghệ và đồ gỗ cao
cấp. Gỗ Hoàng đàn có chứa tinh dầu có mùi
thơm đặc trưng, tinh dầu trong gỗ có tác dụng
xua đuổi Gián, Chuột, Nhện và chống mối mọt
rất hiệu quả. Mang mùi hương gỗ nồng ấm êm
dịu giúp giảm căng thẳng, kích thích nhẹ
nhàng, giúp sảng khoái, tạo cảm giác bình yên,
thư thái, giảm mệt mỏi, giảm căng thẳng thần
kinh, giúp tái tạo nâng cao cảm giác hưng phấn
(Võ Văn Chi, 2004; Pham Van The, 2013). Và
hiện nay các loài này đang bị khai thác khá
nhiều, do vậy chúng đang nằm trong danh sách
loài thực vật cần được bảo tồn của quốc gia.
Hoàng đàn là loài đã được đưa vào Sách Đỏ
Việt Nam (1996, 2007) và Danh mục Động
thực vật rừng nguy cấp quý hiếm nhóm I
(nhóm IA) trong nghị định 32/2006/NĐ-CP
của Chính phủ nước cộng hòa xã hội chủ nghĩa
TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 1- 2020
3
Công nghệ sinh học & Giống cây trồng
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành
lựa chọn bốn đoạn trình tự ADN để sử dụng
làm mã vạch ADN là: ITS, rbcL, trnH-psbA và
ITS2. Trong số đó, các đoạn rbcL, trnH-psbA
là các đoạn ADN nằm ở hệ gen lục lạp, đoạn
ITS, ITS2 nằm ở hệ gen nhân (Chen S.Y.H. et
al., 2010; Ford C.S. et al., 2009; Hamilton
M.B., 1999). Tuy có vị trí và mức độ phân hóa
khác nhau, các đoạn trình tự này đều có tính
đặc trưng cao cho loài, có thể đem lại kết quả
khả quan nhằm phân loại, giám định và xác
định mối quan hệ di truyền, từ đó góp phần
nâng cao hiệu quả bảo tồn và phát triển loài
Hoàng đàn ở Việt Nam.
thực hiện trong tổng thể tích 20 μl, bao gồm:
H2O deion (7 µl), 2x PCR Master mix Solution
(10 µl), 10 pmol/µl mồi xuôi (1,0 µl), 10
pmol/µl mồi ngược (1,0 µl) và 50 ng/µl ADN
khuôn (1 µl). Chương trình phản ứng PCR:
95oC trong 5 phút; (95oC: 30 giây, 55oC: 30
giây, 72oC: 1 phút) lặp lại 40 chu kỳ; 72oC
trong 5 phút; bảo quản sản phẩm PCR ở 4oC.
Nhiệt độ gắn mồi các phản ứng khác nhau phụ
thuộc và cặp mồi sử dụng. Mỗi phản ứng PCR
lặp lại 3 lần trên mỗi mẫu thí nghiệm. Trình tự
các
cặp
mồi
ITS
(IsP2F:
ACGAATTCATGTCCGGTGAAGTGTTCG;
IsP2R:
TAGAATTCCCCGGTTCGCTCGCCGTTAC);
2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
mồi
rbcL
(rP1F:
2.1. Đối tượng, vật liệu, hóa chất
Đối tượng nghiên cứu: loài Hoàng đàn
Cupressus tonkinensis Silba ở Lạng Sơn.
ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC;
rP1R: GTAAAATCAAGTCCACCTCG); mồi
Vật liệu nghiên cứu: mẫu lá bánh tẻ của cây
Hoàng đàn, lấy 3 mẫu lá từ 3 cây khác nhau.
Sau khi thu, mẫu được bảo quản trong túi nilon
có chứa hạt silica gel hút ẩm, sau đó được bảo
quản ở -20oC để tách chiết ADN phục vụ
nghiên cứu. Kí hiệu các mẫu Hoàng đàn được
lấy theo chữ viết tắt họ và tên khoa học của
loài: CCT12.1; CCT12.2; CCT12.3.
Mồi được sử dụng để nhân các đoạn trình tự
được thiết kế dựa trên các tài liệu đã được công bố.
Hóa chất: Kit tách chiết DNA tổng số (Plant
DNA Isolation Kit) của hãng Norgen, Canada;
Hóa chất cho phản ứng PCR nhân bản các
đoạn mã vạch ADN: Master mix của hãng
Intron Biotechnology, Hàn Quốc; Kit tinh sạch
sản phẩm PCR (PCR Purification Kit) của
Norgen, Canada; Hóa chất cho điện di trên gel
Agarose: Agarose, DNA marker, Redsafe…
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ các
mẫu lá của cây Hoàng đàn theo hướng dẫn của
Kit (Plant DNA Isolation Kit). Xác định nồng
độ và độ tinh sạch của dung dịch ADN tổng số
bằng phương pháp quang phổ kế. Nhân bản
đoạn gen ITS, rbcL, trnH-psbA và ITS2 từ các
mẫu ADN tổng số bằng kỹ thuật PCR trên máy
PCR 9700 Thermal Cycler Applied
Biosystems (Mỹ), mỗi phản ứng PCR được
trnH-psbA
CGCGCATGGTGGATTCACAATCC;
psbPR1: GTTATGCATGACGTAATGCTC);
mồi
(trnPF1:
ITS2
(IsP1F:
IsP1R:
ATGCGATACTTGGTGTGAAT;
TCCTCCGCTTATTGATATGC). Kết quả
PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel
agarose 1%, quan sát kết quả dưới đèn cực tím
(UV) và chụp ảnh bằng hệ thống Dolphin -
Doc Image system của hãng Wealtec (Mỹ).
Sản phẩm PCR được tinh sạch theo hướng dẫn
của kit tinh sạch sản phẩm PCR (PCR
Purification Kit) của Norgen, Canada. Sau khi
tinh sạch sản phẩm PCR được gửi cho phòng
thí nghiệm 1st Base ở Malaysia để giải trình tự.
Trình tự nucleotide của đoạn ADN được xác
định tại bằng máy giải trình tự, sử dụng bộ Kit
BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing.
Trình tự nucleotide của đoạn ADN được xử
lý, phân tích bằng các phần mềm chuyên dụng
như DNAClub, Biohit, Mega6... Trình tự
nucleotide của các đoạn mã vạch ADN sau khi
xử lý được đăng ký trong ngân hàng cơ sở dữ
liệu ADN của Việt Nam (DNABank.vn). Trình
tự mã vạch DNA sau xử lý được xử lý trên hàng
gen quốc tế NCBI để tìm ra sự tương đồng loài
Hoàng đàn nghiên cứu so với các loài khác và
trên cơ sở đó xây dựng cây phân loại.
4
TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 1- 2020
Công nghệ sinh học & Giống cây trồng
kiểm tra sự nguyên vẹn của sản phẩm. Kết quả
điện di cho thấy các băng ADN khá sắc nét,
không có sản phẩm phụ, điều này khẳng định
ADN tổng số còn nguyên vẹn, ít đứt gãy và
sạch. Sản phẩm tách chiết ADN tổng số đảm
bảo yêu cầu kỹ thuật làm khuôn cho nhân bản
các đoạn ADN quan tâm bằng kỹ thuật PCR.
3.2. Kết quả nhân bản các đoạn mã vạch
ADN bằng kỹ thuật PCR
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số từ lá
cây Hoàng đàn
ADN tổng số sau khi được tách chiết từ các
mẫu lá cây Hoàng đàn bằng Kit tách chiết của
hãng Norgen được pha loãng để xác định nồng
độ và độ tinh sạch. Kết quả xác định nồng độ
và độ tinh sạch của dung dịch ADN tổng số
cho thấy, dung dịch ADN tổng số có nồng độ
dao động từ
3
-
5
µg/µl; Tỷ số
ADN tổng số tách chiết từ các mẫu lá của
cây Hoàng đàn được sử dụng làm khuôn để
nhân bản các đoạn gen ITS, rbcL, trnH-psbA
và ITS2 bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc
hiệu.
OD260nm/OD280nm trong khoảng từ 1,7 - 2,05,
kết quả này khẳng định đã tách chiết được
ADN với nồng độ cao và đảm bảo độ tinh
sạch. Sau đó, chúng tôi tiến hàng điện di để
Hình A: Đoạn gen ITS
Hình B: Đoạn gen ITS2
Hình C: Đoạn gen rbcL
Hình D: Đoạn gen trnH-psbA
Hình 1. Kết quả PCR nhân gen các đoạn mã vạch ADN
(CCT12.1: Hoàng đàn mẫu 1; CCT12.2: Hoàng đàn mẫu 2; CCT12.3: Hoàng đàn mẫu 3)
Phản ứng PCR được lặp lại 3 lần trên mỗi
mẫu thí nghiệm. Kết quả PCR sau khi kiểm tra
bằng điện di trên gel agarose 1% (hình 1) cho
thấy, xuất hiện băng ADN có kích thước tương
ứng với kích thước của các đoạn mã vạch
ADN dự kiến. Sản phẩm PCR các đoạn mã
vạch ADN ở hình 1 cũng cho thấy, không có
băng ADN phụ xuất hiện, như vậy sản phẩn
PCR rất đặc hiệu, sau khi tinh sạch có thể sử
dụng trực tiếp các sản phẩm này để xác định
trình trình tự nucleotide.
3.3. Kết quả xác định và phân tích trình tự
nucleotide của đoạn mã vạch ADN
Kết quả xác định trình tự nucleotide của các
sản phẩm PCR, sau khi phân tích cho thấy
trình tự nucleotide của mỗi đoạn ADN ở cả 3
lần lặp không có sự khác biệt về trình tự
nucleotide của mỗi đoạn ở các lần lặp lại và
TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 1- 2020
5
Công nghệ sinh học & Giống cây trồng
các mẫu trong cùng một loài. Trình tự
nucleotide của các đoạn mã vạch ITS, rbcL,
trnH-psbA và ITS2 đã được đăng ký trong
ngân hàng dữ liệu ADN Việt Nam
(DNABank.vn), với các mã số (Barcode ID)
tương ứng là: rbcL: CCT0001; trnH-psbA:
CCT0002; ITS2: CCT0003; ITS: CCT0004.
Bảng 1. Trình tự nucleotide của đoạn gen ITS, gồm 1643 bp
(Barcode ID:CCT0004)
CCTATCAAGCTCGCACGGCGATTGATGTCGGCAACGCTCACGAGAAGTTCATTGAACCTTATCATTTAGA
GGAAGGAGAAGTCGTAACAAGGTTACCGTAGGTGAACCTGCGGTAGGATCATTGTCGGTTCGAGACCCT
GAATCGTGTAGGGGATGGAGCTGGCCTCCTCCCCGCCCCCAAAATCTCGGCGACGTGCGGACACTTGGC
CCTGCAGCGATGTGCTGGACGGCCAAGCTACGGGTCCAGCGCCGTCAAGGTGGAGGGTCACATCGAATG
CCGTGATCGAAAGCGTGGATTCCCCGCGGGGCGAAGAGACTCGGATGCAAATCTGGATTACGATCGGTG
CCTTCGAACGACGTCTGCGTCGGAGCGAGGGGTCCCTGCTCGGTTGTAGTTCAGAGGGGGTCCGGGCCT
CGTCCCCCGTTGAGATTTCATGGCCCGGTCGCGTGCGCGGCGCTGTGCCAGGGATCCGTCGTTTCGACGG
CGGCAAGTCGGGACTGCCGCAACCCCCCGTTGCCTTGCCCAGGTGTGTTAACTCGTCGCTCGGAGCGTTC
TGTGTCTAGGATGGGTGCACTCGCAAGATTTGCGGGGCAGGGGCCCCGTCCGATGACACGGCTCTCCCA
TGCGTCGACTCACACCTTTGCGAGGTGATGGGGCGGGGACACACCAGAGCGTTCCTCGTCGCACCCATT
GGGTGCTCGGGGTTCGGGATGTGTCAACACCCAACACACGGGGTGCATCGCGCACCTTAGAAAATCCAA
AGAATGAAACCGCGAATCCAGCGCCCTTGCGCGGCTCGGGTTCGCCCGAAAAGACAAAAACCTTAACCA
AAATTCACGGACTCTTCGGGCAACGGAATATTCTCGGCCTCTCGCCCACGAATGAAAGAATGTTAACCG
AAAATGCCGAATACTTTAAGTGGTGAAATTGGCAGAAATCCCCGGGGAAATCCATCCAAGTCCTTTTGA
AACGCCAAGTTTGGCGCCCCCGAAGGCCCTCCGGCCCAAAGGGGCCACCGTTCCTGGCTTTGGGGGCGT
CCCCCAACTAACAAAAAATTGCCCCCTTCCCCCCAAGCCGAAGGGAAACGGGAAAAAATGGGGCCCTTT
CCCCGGTGGTCTCCTCCAAATTTGGGCCCCCGGTTTCCTGTGCTTGTAAATATGTAAGCTCACCTAAATG
GTTCCTCTTTCCCTAGATCCTTCGTTCTCCCTGTAACATAAACGCGGTGGTGGGGGCCTCGCCCCTTAAA
AGAATGGTTCCCGTTGGTCCGGTGTTGTGGATTTGTGTTGCCCCCCCCCTTGTGAAACGCTTAAAGACCA
AGGAGTGTTATACCCGCTGCCCGCGTCATAAGAGAAAAAAACTTTTTTTGTAAATCTTACCTCCGCAGAG
TGGGGCTCTCGCTCAACTCGTGGGGGTTGCCACTCTTGTTCCACTCGTCCTCTATAGGTTATGAAGGTGT
GGGAGTGACTTTCAGCCGGTTCCTACTTCATAGAGTTCTACCAATGTATGATTATCGCTCGCGTGTATAT
GCGCACTCTCCTCAAAAATTTTTATTTTAACGTGAGTTGTTGTAGGATATATAGTATATCACCCTCGTGTG
TGTGTTAGATTTTACTATTGTAGAGCACGTGGGTTATGTGGCGCG
Các trình tự này sau đó được xử lý trên
ngân hàng gen quốc tế NCBI để tìm ra sự khác
biệt giữa các loài có trình tự tương đồng theo
đoạn gen ITS ở loài Hoàng đàn bằng cách sử
dụng công cụ BLAST. Một số loài có trình tự
gen tương đồng dùng so sánh với loài Hoàng
đàn được dùng để xây dựng cây phát sinh
chủng loại được thể hiện ở hình 2.
Hình 2. Cây phân loại dựa vào trình tự trên đoạn ITS tạo bởi NCBI
6
TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 1- 2020
Công nghệ sinh học & Giống cây trồng
Bảng 2. Trình tự nucleotide của đoạn gen rbcL, gồm 573bp
(Barcode ID:CCT0001)
GCCTCATGCTGCATGCTCGTTACTAAGATTACAGATTGACTTATTATACTCCGGACTAT
CAGACCAAAGATACTGATATCTTGGCAGCATTCCGAGTCACTCCTCAACCTGGAGTGC
CCCCCGAAGAAGCGGGGGCCGCGGTAGCTGCCGAATCTTCCACTGGTACATGGACCA
CTGTTTGGACCGATGGTCTTACCAGTCTTGATCGCTACAAGGGGCGATGCTACGATAT
TGAACCCGTTCCTGGAGAAGAAACTCAATTTATTGCCTATGTAGCTTACCCTTTAGAC
CTTTTTGAAGAAGGTTCTGTGACTAACCTGTTTACTTCCATTGTGGGTAATGTATTTGG
ATTCAAAGCCTTGCGGGCTCTACGTCTGGAAGATTTACGAATTCCTCCTGCTTATTCAA
AAACTTTTCAAGGACCACCTCATGGTATTCAAGTTGAAAGAGATAAATTAAACAAAT
ATGGTCGTCCTTTGTTGGGATGTACTATCAAACCTAAATTGGGTCTATCTGCCAAGAA
TTATGGTAGAGCGGTTTATGAATGTCTCCGTGGTGGACTTGGATTTTACA
Các trình tự này sau đó được xử lý trên
ngân hàng gen quốc tế NCBI để tìm ra sự khác
biệt giữa các loài. Một số loài có trình tự gen
tương đồng theo đoạn rbcL dùng so sánh với
loài Hoàng đàn được dùng để xây dựng cây
phát sinh chủng loại được thể hiện ở hình 3.
Hình 3. Cây phân loại dựa trình tự trên đoạn vào rbcL tạo bởi NCBI
Bảng 3. Trình tự nucleotide của đoạn trnH-psbA, gồm 507 nucleotide
(Barcode ID:CCT0002)
CGCCCAACTAATTGACAGTCTCTGTCTACGGTCATTCCATTTCAAGAATGGATGGTTCT
AAGCCCCGAAAACCAACTAATAATGAAACTATTCTATTATTTAGAATAGTTATTAATT
TGTTGCACTTGCAATGCAACTCTCACACAAGTTAGTGACATTGACATTTTTTTTTTTTA
ATAGTTTTGTTTTGGGTATTAAAAAAAAGATCTGAGCCAATACTCGCTACAAATTAAT
AATTGATATTATGTATCCATGGCTAAATGGTAAAAGCACCCAACTCATAATTGGGAAG
TCGCGGGTTCAATTCCGGCTGGATGCACAGTTATAGTTATTGGGCTCTGTTCGCTCGC
AATAACTATAAAATTAGACGGAAAAAGCAGTACCAAATTGGCACTGCTTTCTTTTTAG
GATTGAAATACACTAACAATCCACCTTGAATAATTAGCCGTTTATAGAATTACC
Các trình tự thu được này sau đó được xử lý
trên ngân hàng gen quốc tế NCBI để tìm ra sự
khác biệt giữa các loài. Một số loài có trình tự
gen tương đồng theo đoạn trnH-psbA dùng so
sánh với loài Hoàng đàn được dùng để xây
dựng cây phát sinh chủng loại được thể hiện ở
hình 4.
TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 1- 2020
7
Công nghệ sinh học & Giống cây trồng
Hình 4. Cây phân loại dựa vào trình tự trên đoạn TrnH-psbA tạo bởi NCBI
Bảng 4. Trình tự nucleotide của đoạn ITS2, gồm 349 nucleotide
(Barcode ID:CCT0003)
AGACGGGGATCTCAGTCTTTGACGCAGTTGCGCCCGAGGCCTCGGCCAAGGGCACGT
CTGCTTGGGCGTCGCACTACAAAATTGCCCTCCCCAGCGAGGAGCGGAGATGGCCGT
CCGTGTCCCCAAGTGGCGCGGTCGGCTGAAATGAGCACGAGGTCCGTCGATCCGTCG
CGACGAGCGGTGGCTCCCAAAAGGCCGGCGTTGGTTTGCGCTGATCGAACGATTCCTC
GCGAGGAACTTTATTCTGGGTCCAGCGGCCCGCCGCAGTGCGGGCATGCCGCATCTCT
ACCGCGTCCCCAAGTCAGGCGTGAATACCCGCTGAGTTTAAGCATATCAATAAGCGG
AGGAA
Các trình tự này sau đó cũng được xử lý
trên ngân hàng gen quốc tế NCBI để tìm ra sự
khác biệt giữa các loài. Một số loài có trình tự
gen tương đồng theo đoạn trnH-psbA dùng so
sánh với loài Hoàng đàn được dùng để xây
dựng cây phát sinh chủng loại được thể hiện ở
hình 5.
Hình 5. Cây phân loại dựa vào trình tự trên đoạn ITS2 tạo bởi NCBI
8
TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 1- 2020
Công nghệ sinh học & Giống cây trồng
Từ cây phát sinh chủng loại của 4 đoạn gen
ITS, rbcL, ITS2 và trnH-pbsA cho thấy loài
Hoàng đàn (Cupressus tonkinensis) có sự
tương đồng cao nhất với cùng một loài
Cupressus funebris. Vì vậy Cupressus
tonkinensiscó quan hệ họ hàng gần nhất với
loài Cupressus funebris. Do đó, chúng tôi lựa
chọn loài Cupressus funebris làm tham chiếu
so sánh để tìm ra khả năng phân biệt tốt nhất
của 4 đoạn gen mà chúng tôi lựa chọn.
Dựa vào kết quả so sánh trình tự các đoạn
ITS, rbcL, ITS2 và trnH-pbsA của Cupressus
tonkinensis với trình tự gen của loài Cupressus
funebris, chúng tôi lập được bảng so sánh khả
năng phân biệt của đoạn trình tự ITS, rbcL,
ITS2, và trnH-pbsA như ở bảng 5.
Bảng 5. Bảng so sánh khả năng phân biệt của các đoạn trình tự ITS, rbcL, ITS2 và trnH-pbsA
Tên đoạn gen
Số điểm sai khác
Kích thước trình tự
ITS
54
rbcL
17
ITS2
5
trnH-psbA
9
865
548
296
466
6,2%
3,1%
1,6%
1,9%
Tỷ lệ sai khác
Từ kết quả phân tích trên cho thấy khi so
sánh đoạn trình tự ITS của loài Cupressus
tonkinensis với loài Cupressus funebris có 54
điểm sai khác, nhiều hơn 3 đoạn gen còn lại.
Tỷ lệ sai khác của đoạn trình tự này cũng cao
hơn 3 đoạn còn lại với tỷ lệ 6,2%. Như vậy,
đoạn ITS có khả năng phân biệt cao hơn so với
đoạn rbcL, ITS2 và trnH-pbsA khi so sánh loài
Cupressus tonkinensis với loài Cupressus
funebris.
4. KẾT LUẬN
Đã tách chiết được 3 mẫu ADN tổng số của
Hoàng đàn (Cupressus tonkinensis Silba).
Nhân gen thành công các đoạn gen ITS, rbcL,
ITS2 và trnH-pbsA từ ADN tổng số của loài
Hoàng đàn bằng kỹ thuật PCR. Kết quả xác
định trình tự nucleotide của các đoạn mã vạch
ADN cho thấy đoạn gen ITS có kích thước là
1643bp, đoạn rbcL có 573bp, đoạn trnH-psbA
có 507 bp và đoạn ITS2 có 349 bp. Trình tự
nucleotide của các đoạn mã vạch ITS, rbcL,
trnH-psbA và ITS2 đã được đăng ký trong
ngân hàng dữ liệu ADN Việt Nam với các mã
số (Barcode ID) tương ứng là: rbcL:
CCT0001; trnH-psbA: CCT0002; ITS2:
CCT0003; ITS: CCT0004. So sánh trình tự
nucleotide của các đoạn mã vạch ADN (rbcL,
ITS, trnH-psbAvà ITS2) của loài Hoàng đàn
với trình tự nucleotide của các đoạn mã vạch
tương ứng của các loài Hoàng đàn khác trên
ngân hàng gen quốc tế NCBI đã chỉ ra: đoạn
gen ITS tương đồng 94% với loài Cupressus
funebris, đoạn gen rbcL tương đồng 97% với
loài Cupressus funebris, đoạn gen ITS2 tương
đồng 99% với loài Cupressus funebris, đoạn
genTrnH-psbA tương đồng 99% với loài
Cupressus funebris. Sau đó, so sánh trình tự
các đoạn ITS, rbcL, ITS2 và trnH-pbsA của
loài Hoàng đàn nghiên cứu (Cupressus
tonkinensis) với loài Cupressus funebris tìm ra
được chỉ thị ITS làm mã vạch có khả năng
phân biệt cao hơn so với đoạn rbcL, ITS2 và
trnH-pbsA.
THẢO LUẬN
Từ kết quả so sánh của 4 chỉ thị cho thấy
đoạn ITS là đoạn cho khả năng phân biệt tốt
nhất với 54 điểm sai khác, và tỷ lệ sai khác
6,2%. Kết hợp tỷ lệ tương đồng và cây phân
loại dựa vào đoạn ITS được xây dựng bởi ngân
hàng quốc tế NCBI cho thấy (hình 2): Trong
cùng chi Hoàng đàn: loài Cupressus
tonkinensis có tỷ lệ tương đồng cao nhất với
Cupressus funebris là 94%, với Cupressus
chengiana và Cupressus gigantean là 92%, với
Cupressus dupreziana là 90%. Hơn nữa, tỷ lệ
tương đồng này càng giảm so với các loài
thuộc chi khác như: loài Cupressus tonkinensis
có tỷ lệ tương đồng thấp nhất với các loài
thuộc chi Bách xù Juniperus martinezii,
Juniperus flaccid, Juniperus oxycedrus,
Juniperus cedrus là 87%. Do vậy, đoạn ITS là
đoạn phù hợp để sử dụng là DNA barcode cho
loài Hoàng đàn mà chúng tôi nghiên cứu.
TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 1- 2020
9
Công nghệ sinh học & Giống cây trồng
6. Ford C.S, Ayres K.L, Toomey N., Haider N., Stahl
J.V.A., Kelly L.J., Wikström N., Hollingsworth P.M.,
Duff R.J., Hoot S.B., Cowan R.S., Chase M.W.,
Wilkinson M.J. (2009). Selection of candidate coding
DNA barcoding regions for use on ADN plants.
Botanical Journal of the Linnean Society. 159 (1): 1-11.
7. Hamilton M.B. (1999). Four primer pairs for the
amplification of chloroplast intergenic regions with
intraspecific variation. Molecular Ecology 8: 513-525.
8. Kress J.W, Erickson D.L. (2008). DNA barcodes:
Genes, genomics, and bioinformatics. Proc Natl Acad
Sci U S A. 105(8):2761-2762
9. Kress J.W, Wurdack K.J, Zimmer E.A, Weigt
L.A, Janzen D.H., (2005). Use of DNA barcodes to
identify flowering plants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
102 (23): 8369–74.
10. Pham Van The, Phan Ke Loc, Nguyen Tien Hiep
and John Silba. (2013). The Status of Wild and
Cultivated Populationsof Cupressus tonkinensis Silba in
Vietnam. Bull. CCP 2 (1): 10-16.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Anders R. (2012). DNA barcoding as a tool for the
identifcation of unknown plant material: A case study on
medicinal roots traded in the medina of Marrakech.
M.SC thesis, Uppsala University CBOL ABS Brochure.
2. Alvarez I.W.J.F. (2003). Ribosomal ITS sequences
and plant phylogenic inference. Molecular phylogentics
and Evolution 29: 417-434.
3. Aron J.F, Kevin S.B, Prasad R.K, Kevin S.
Burgess, Prasad R. Kesanakurti, Sean W. Graham,
Steven G. Newmaster, Brian C. Husband, Diana M.
Percy, Mehrdad Hajibabaei, Spencer C. H. Barrett.
(2008). Multiple multilocus DNA barcodes from the
plastid genome discriminate plant species equally well.
PLoS ONE. 3(7): e2802.
4. Chase M.W, Salamin N., Wilkinson M., Dunwell
J.M., Kesanakurthi R.P., Haider N., Savolainen V.
(2005). Land plants and DNA barcodes: Short-term and
long-term goals. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci.
360:1889-1895.
11. Von Cräutlein M. Pietiläinen M., Korpelainen
H., Rikkinen J. (2011). DNA barcoding: a tool for
improved taxon identification and detection of species
diversity. Biodiversity and conservation 20: 373-389.
12. Võ Văn Chi (2004). Từ điển thực vật thông
dụng, tập 2. NXB Khoa học và Kỹ thuật.
5. Chen S.Y.H, Han J., Liu C., Song J., shi L., Zhu
Y., Ma X., Gao X., Pang X., Luo K., Li Y., Li X., Leon
C. (2010). Validation of the ITS2 region as a novel
DNA barcodes for identifying medicinal plant species.
Plos one 5: e8613.
STUDY ON IDENTIFICATION OF DNA BARCODE SEQUENCE
OFCupressus tonkinensis TO IDENTIFY PLANT SPECIES
Ha Van Huan1, Hoang Minh Trang1, Bui Thi Mai Huong1
1Vietnam National University of Forestry
SUMMARY
Cupressus tonkinensis is a species of high economic value with good wood and fragrant wood. Nowaday, these
species are being exploited quite a lot. Therefore, these species are still facing extinction. So, it is necessary to
identify DNA barcode fragments of the Cupressus tonkinensis for species identification. The genomic DNA
was extracted from leaf tissue of Cupressus tonkinensis. The DNA barcodes (ITS, rbcL, trnH-psbA and ITS2)
were amplified from total DNA of Cupressus tonkinensis by PCR technique. The PCR products indicated that
all the bands have the size similar to the theoretical size of ITS, rbcL, trnH-psbA and ITS2. Results nucleotide
sequencing of PCR product samples showed that the size of the isolated ITS gene fragment is1643 bp, rbcL
fragment is 573 bp, trnH-psbA fragment is 507 bp and ITS2 fragment is 349 bp. And then, these sequences
were compared with Cupressus funebris in NCBI we found that: ITS gene fragment is similar to 99%, rbcL
gene fragment is similar to 100%, ITS2 gene fragment is similar to 98%, TrnH-psbA gene fragment is similar
to 99%. The nucleotide sequences of ITS, rbcL, ITS2, TrnH-psbA have been registered on the DNABank.vn
with Barcode ID CCT0001; CCT0002; CCT0003 and CCT0004. Recommendation for using ITS molecular
marker as DNA barcode to identify Cupressus tonkinensis in Viet Nam.
Keywords: Cupressus tonkinensis, DNA barcoding, identify species.
Ngày nhận bài
Ngày phản biện
Ngày quyết định đăng
: 15/02/2020
: 16/3/2020
: 23/3/2020
10
TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 1- 2020
8 trang
09/01/2024
16820
Free
Bạn đang xem tài liệu "Nghiên cứu xác định đoạn DNA Barcode cho loài hoàng đàn (Cupressus tonkinensis) phục vụ giám định loài", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên
File đính kèm:
- nghien_cuu_xac_dinh_doan_dna_barcode_cho_loai_hoang_dan_cupr.pdf
