Nhân giống cây cát tường (Eustoma Grandiflorum L.) qua hai con đường phát sinh phôi sinh dưỡng và phát sinh cơ quan
Journal of Science – 2016, Vol. 11 (3), 110 – 118 Part C: Agricultural Sciences, Fisheries and Biotechnology
NHÂN GIỐNG CÂY CÁT TƯỜNG (EUSTOMA GRANDIFLORUM L.) QUA HAI
CON ĐƯỜNG PHÁT SINH PHÔI SINH DƯỠNG VÀ PHÁT SINH CƠ QUAN
Trần Thị Ngọc Lan
Trường Cao đẳng Kinh tế Kỹ thuật Lâm Đồng
Thông tin chung:
ABSTRACT
Ngày nhận bài: 18/06/2015
Ngày nhận kết quả bình duyệt:
25/08/2015
Lisianthus (Eustoma grandiflorum L.) is an ornamental plant with beautiful
flowers. Due to low germination of its seeds, usual techniques for its
propagation are not efficient. This present study was aimed to investigate the
morphogenesis of different explants for useful micropropagation of Lisianthus.
The results showed that calli were formed and developed by culturing in vitro
leaf explants derived shoots on MS medium supplemented with 2 mg/l α-NAA or
0.5 mg/l 2,4-D with the rate of 100%. The green, spongy calli were able to have
shoot formation (82.50%), and the yellow, friable calli formed plantlets derived
from somatic embryos (84.17%) in MS medium containing 0.5 mg/l BA. Results
show rootlet formation in 0.5 mg/l α-NAA using MS medium for these shoots.
All of plantlets were survived and adapted after 4 weeks of acclimatization in
the ex vitro condittion. No abnormal morphological changes were found in
Lisianthus plantlets with using propagation methods via organogenesis and
embryogenesis.
Ngày chấp nhận đăng: 09/2016
Title:
The micropropagation of
Lisianthus (Eustoma
grandiflorum L.) through the
way of organogenesis and
embryogenesis
Từ khóa:
Chồi, Eustoma grandiflorum L.,
mô sẹo, phôi sinh dưỡng
Keywords:
Callus, Eustoma grandiflorum
L., shoot, somatic embryo
TÓM TẮT
Cát tường (Eustoma grandiflorum L.) là loài cây trang hoàng, cho hoa bền,
đẹp. Do tỷ lệ nảy mầm của hạt thấp, những kỹ thuật nhân giống thông thường
không đạt hiệu quả. Vì vậy, nghiên cứu này được thực hiện nhằm khảo sát sự
phát sinh hình thái của mẫu cấy nhằm mục đích nhân nhanh và đồng loạt giống
cây Cát tường. Qua nghiên cứu cho thấy, nuôi cấy mẫu lá in vitro có nguồn gốc
từ chồi trên môi trường MS bổ sung 2 mg/l α-naphtaleneacetic acid (α-NAA)
hoặc 0,5 mg/l 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) cho tỷ lệ hình thành mô
sẹo đạt 100%. Loại mô sẹo đặc vàng, dạng hạt phát sinh phôi sinh dưỡng, tạo
thành cây con (tỷ lệ đạt 84,17%) và loại mô sẹo xốp, xanh hình thành chồi (tỷ lệ
đạt 82,50%) trên môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l 6-Benzylaminopurine (BA).
Các chồi hình thành cây con khi nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l
α-NAA. Tất cả các cây con có nguồn gốc từ hai loại mô sẹo này đều thích nghi
tốt trong điều kiện ex vitro. Không ghi nhận những thay đổi về hình thái bất
thường nào từ những cây hình thành từ hai con đường phát sinh cơ quan và
phát sinh phôi.
1. GIỚI THIỆU
tím, trắng có viền hay không. Đây là một trong 10
loại cây cắt cành có độ bền hoa hàng đầu trên thế
giới (Rezaee và cs., 2012). Cây có khả năng
Cây Cát tường cho hoa đẹp, thanh nhã với nhiều
màu sắc khác nhau như: xanh lá mạ, hồng, vàng,
110
Journal of Science – 2016, Vol. 11 (3), 110 – 118 Part C: Agricultural Sciences, Fisheries and Biotechnology
kháng bệnh, chịu được acid và có khả năng đáp
ứng với stress nhiệt độ cao. Tuy nhiên, hạt có kích
thước rất nhỏ (19000 hạt/g), hạt rất khó gieo. Cây
gieo từ hạt có kiểu hình không ổn định và có tỷ lệ
nảy mầm không cao (dễ bị thất thoát hạt). Các
công trình nghiên cứu trước đây, nhân giống in
vitro thường vào mẫu bằng nuôi cấy hạt trong
điều kiện in vitro (Lutoslawa và cs., 1988) hay
nuôi cấy chồi, nhân chồi và cắt đoạn chồi.
Semeniuk và Griesbach (1987) nhân giống Cát
tường thông qua việc nuôi cấy chồi nách, lá và
huyền phù tế bào. Furukawa (1993) nghiên cứu vi
nhân giống tái sinh cây Cát tường từ những đoạn
lá trên môi trường LS (Linsmaier & Skoog, 1965)
bổ sung 1 mg/l BA cho kết quả tái sinh chồi từ lá.
Sự phát sinh phôi sinh dưỡng từ nuôi cấy huyền
phù mô sẹo hình thành từ các mảnh lá Lissianthus
russelianus Hook. hay từ các mảnh lá có nguồn
gốc từ nuôi cấy in vitro cũng được nghiên cứu
(Nhut và cs., 2006; Ruffoni và cs., 1990). Rezaee
và cs. (2012) đã nghiên cứu sự hình thành phôi
sinh dưỡng từ các mẫu lá của Eustoma
grandiflorum L. trên môi trường LS và B5 hay
gần đây Hassan và cs. (2014) đã thành công trong
việc tạo mô sẹo từ lá cây Cát tường và phát sinh
chồi từ mô sẹo này. Tuy nhiên, các nghiên cứu
trên chưa làm rõ sự phát sinh hình thái từ các mẫu
cấy.
Mục tiêu của bài báo này là nghiên cứu sự phát
sinh hình thái của mẫu lá, lóng thân và đầu rễ từ
các chồi cây nuôi cấy in vitro của cây Cát tường,
khảo sát sự hình thành và nhân lên của mô sẹo, sự
phát sinh và phát triển của phôi sinh dưỡng với
tần số cao từ mô sẹo nuôi cấy từ lá của cây Cát
tường để chọn ra phương thức nhân giống thích
hợp cho loài cây có giá trị này.
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
2.1 Vật liệu
Cây Cát tường cho hoa kép, đẹp, màu vàng nhóm
Mariachi (Eustoma grandiflorum Mariachi
Yellow imp.) có chiều dài 60 -70 cm, 7 tháng tuổi
có nguồn gốc từ vườn cây của nông dân, ấp Vạn
Thành, Đà Lạt. Cây có độ bền của hoa từ 13 – 27
ngày. Cây với các chồi ngọn và chồi nách được
chọn làm vật liệu để thu lấy chồi (Hình 1).
Hình 1. Thân cây Cát tường (Eustoma grandiflorum Mariachi Yellow imp.)
mang các chồi ngọn và chồi nách (mũi tên).
Môi trường nuôi cấy in vitro
dịch nước rửa chén Sunlight, rửa lại nhiều lần
bằng vòi nước 15 phút, rửa bằng nước đã hấp vô
trùng (HVT), khử trùng bằng cồn ethylic 75%
(v/v) trong 30 giây, rửa nước HVT 3 lần, ngâm
trong dung dịch HgCl2 0,1% 6 phút, rửa lại 5 lần
bằng nước HVT. Sau đó, tách các ngọn chồi và
chồi nách, tách bỏ các lá bao, cho đến khi lộ ra
đoạn chồi mang hai đến ba lá/chồi, rửa sạch bằng
nước cất HVT và cấy vào môi trường MS bổ sung
30 g/l sucrose và 8 g/l agar với 5 chồi/bình. Các
chồi này được nuôi trong 2 tuần để thu lấy cây
con làm nguyên liệu cho việc cảm ứng tạo mô
sẹo.
Sử dụng môi trường MS (Murashige & Skoog,
1962). Tùy thuộc từng thí nghiệm sẽ bổ sung hay
không bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thực
vật (CĐHSTTV) khác nhau (α-NAA, BA, 2,4-D).
Môi trường nuôi cấy có pH = 5,7. Các môi trường
nuôi cấy được cho vào các bình thủy tinh (thể tích
bình: 250 ml với 40 ml môi trường nuôi cấy/bình)
ο
và được hấp khử trùng trong 20 phút ở 121 C, 1
atm.
2.2 Phương pháp
2.2.1 Vào mẫu, nuôi cấy chồi ex vitro
Các đoạn mẫu có chiều dài 8 cm -10 cm được rửa
sạch dưới vòi nước đang chảy, rửa lại bằng dung
111
Journal of Science – 2016, Vol. 11 (3), 110 – 118 Part C: Agricultural Sciences, Fisheries and Biotechnology
2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của các CĐHSTTV
lên sự phát sinh hình thái của mẫu lá cây
Cát tường
các nồng độ khác nhau (0; 0,5 và 1 mg/l) để khảo
sát ảnh hưởng của BA lên sự phát sinh hình thái
của mô sẹo cũng như sự hình thành và phát triển
của chồi và phôi sinh dưỡng từ mô sẹo. Mỗi bình
gồm 5 mẫu. Mỗi nghiệm thức gồm 8 bình. Xác
định tỷ lệ hình thành mô sẹo, hình thành cây con,
hình thành chồi, chiều dài chồi, chiều dài rễ và số
rễ, số chồi từ mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy.
Các lá từ cây con in vitro đã nuôi cấy ở thí
nghiệm trên được cắt thành các mảnh có kích
thước (0,6 x 0,6) cm, được nuôi cấy trên môi
trường MS bổ sung α-NAA (0; 1; 1,5 và 2 mg/l)
hoặc 2,4-D (0; 0,5 và 1 mg/l), 30 g/l sucrose và 8
g/l agar. Thí nghiệm gồm 6 nghiệm thức nuôi cấy
trong điều kiện có chiếu sáng và 6 nghiệm thức
nuôi cấy trong điều kiện tối hoàn toàn. Mỗi
nghiệm thức gồm 8 bình với mỗi bình gồm 5 mẫu.
2.2.6 Khảo sát sự hình thành rễ từ các chồi xuất
phát từ mô sẹo và sự thích nghi của cây
con trong điều kiện ex vitro của cây Cát
tường
Khảo sát sự phát sinh hình thái qua việc xác định
tỷ lệ hình thành mô sẹo và tỷ lệ hình thành cấu
trúc nhiều rễ, hình thái, màu sắc của những cấu
trúc này trong điều kiện có chiếu sáng và điều
kiện tối. Số liệu thu nhận sau 5 tuần nuôi cấy.
Đối với các cây con hình thành từ mô sẹo phát
sinh phôi:
Cây con hình thành trong điều kiện in vitro, được
chuyển sang trồng trong nhà kính với giá thể
trồng là 2 phần đất và 1 phần trấu hun. Cây được
trồng trong 4 tuần để khảo sát khả năng ra rễ và
thích nghi của cây trong điều kiện ex vitro.
2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của các loại mẫu lên
sự hình thành mô sẹo của cây Cát tường
Các lá từ đoạn chồi đã nuôi cấy ở thí nghiệm trên
được cắt thành các mảnh có kích thước (0,6 x 0,6)
cm, các lóng thân ngang (đường kính 1 mm, dày 4
mm) hay các đoạn rễ (2 x 0,5) mm, được nuôi cấy
trên môi trường MS bổ sung 2 mg/l α-NAA, 30
g/l sucrose và 8 g/l agar. Thí nghiệm gồm 3
nghiệm thức nuôi cấy trong điều kiện có chiếu
sáng và 3 nghiệm thức nuôi cấy trong điều kiện
tối hoàn toàn. Mỗi nghiệm thức gồm 8 bình với
mỗi bình gồm 5 mẫu. Sau 5 tuần nuôi cấy, khảo
sát tỷ lệ hình thành mô sẹo của những mẫu này
trong điều kiện có chiếu sáng và điều kiện tối.
Đối với các chồi hình thành từ mô sẹo phát sinh
chồi:
Các chồi được chuyển sang môi trường MS bổ
sung 0,5 mg/l α-NAA để chồi hình thành và phát
triển rễ sau 2 tuần nuôi cấy. Sau đó, các cây này
cũng được chuyển ra trồng trong nhà kính, chăm
sóc tương tự như cây từ mô sẹo phát sinh phôi.
2.2.7 Điều kiện nuôi cấy
Nhiệt độ phòng nuôi là (25 ± 1) οC, cường độ ánh
sáng: 2000 lux và độ ẩm không khí: 70%. Trong
thí nghiệm khảo sát sự thích nghi của cây con
trong điều kiện ex vitro thì sử dụng nhà kính có
2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
lên sự tăng sinh mô sẹo và cấu trúc nhiều
rễ của cây Cát tường
ο
nhiệt độ dao động ngày đêm là (17 – 25 ± 1) C,
cường độ ánh sáng dao động từ (1000 – 7000) lux
và độ ẩm không khí: 80%.
Hai loại mô sẹo (vàng, đặc và trắng xanh xốp) và
cấu trúc nhiều rễ thu được ở các thí nghiệm trên
được tiếp tục nuôi cấy trên môi trường tương tự
với việc xác định khối lượng của mô sẹo và cấu
trúc nhiều rễ ở ngày thứ 7, ngày thứ 14 và ngày
thứ 21 để khảo sát sự phát triển của mô sẹo và cấu
trúc nhiều rễ theo thời gian nuôi cấy. Mỗi bình
gồm 5 mẫu. Mỗi nghiệm thức gồm 8 bình.
2.2.8 Quan sát mô học
Làm các loại tiêu bản về mô sẹo với việc cắt lát
theo chiều ngang mẫu cần quan sát, ngâm trong
dung dịch javel 10% trong 15 phút, rửa nước,
ngâm trong dung dịch acid acetic 45% trong 15
phút, rửa nước, nhuộm màu bằng thuốc nhuộm
hai màu đỏ carmin và xanh iod trong 15 phút, rửa
nước và quan sát trên kính hiển vi quang học
Olympus, Nhật với độ phóng đại 40 - 400 lần.
Xác định kích thước mẫu bằng trắc vi thị kính.
2.2.5 Khảo sát sự hình thành chồi và cây con từ
mô sẹo của cây Cát tường
Hai loại mô sẹo (vàng, đặc và trắng xanh xốp)
được chuyển sang môi trường MS bổ sung BA ở
2.2.9 Chỉ tiêu theo dõi
112
Journal of Science – 2016, Vol. 11 (3), 110 – 118 Part C: Agricultural Sciences, Fisheries and Biotechnology
Quan sát màu sắc, hình dạng, tỷ lệ hình thành mô
sẹo. Xác định khối lượng của mô sẹo và cấu trúc
nhiều rễ bằng cân phân tích Sartorius. Xác định số
chồi trung bình trên cụm mô sẹo có khối lượng 1
g, số rễ hình thành trung bình/cây con. Đo chiều
dài chồi và chiều dài rễ của cây bằng thước cặp đo
Insize 2002S. Tỷ lệ phát sinh chồi: số mẫu phát
sinh chồi x 100 trên tổng số mẫu nuôi cấy. Tỷ lệ
hình thành cây con: số mẫu hình thành cây con
với chồi và rễ x 100 trên tổng số mẫu nuôi cấy.
3.2 Ảnh hưởng của CĐHSTTV lên sự phát
sinh hình thái từ lá in vitro
Các mẫu cấy trong điều kiện có chiếu sáng hình
thành mô sẹo nhanh hơn so với mẫu trong điều
kiện tối (27 đến 30 ngày so với 32 đến 35 ngày).
Mô sẹo trong điều kiện có chiếu sáng có màu
vàng xanh, dạng hạt hay xốp trong khi mô sẹo
trong điều kiện tối cho màu trắng vàng, dạng đặc
hay xốp. Khối lượng mô sẹo trong điều kiện có
chiếu sáng cũng cao hơn điều kiện tối. Có lẽ,
trong điều kiện có chiếu sáng, sự hấp thu chất
dinh dưỡng của mẫu cấy sẽ cao hơn. Kết quả này
cũng phù hợp với kết quả của Hassan và cs.
(2014). Ở các nghiệm thức xử lý từ 2,4-D, mẫu
cảm ứng đạt cao nhất ở nồng độ 0,5 mg/l 2,4-D
nhưng tỷ lệ tạo mô sẹo giảm đi khi mẫu được nuôi
cấy ở nồng độ cao hơn (1 mg/l). Có lẽ, 2,4.D ở
nồng độ cao sẽ ức chế sự cảm ứng và hình thành
mô sẹo. 2,4-D làm gia tăng mức auxin của mẫu
cấy, kích thích sự phân chia tế bào tạo mô sẹo.
Tuy nhiên, nồng độ 2,4-D cao sẽ cảm ứng sinh
tổng hợp ethylene. Sự tích lũy ethylene dù chỉ một
lượng nhỏ trong bình nuôi cấy có thể ức chế sự
sinh trưởng và phát triển của nhiều mẫu cấy thực
vật (George và cs., 2008).
2.2.10 Phương pháp xử lý số liệu
Các thí nghiệm trong phòng thí nghiệm và trong
nhà kính được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3
lần lặp lại. Các số liệu thu được là giá trị trung
bình của 3 lần lặp lại. Số liệu được phân tích
thống kê bằng phép thử Duncan (sự khác biệt có ý
nghĩa ở mức xác suất P < 0,05) với phần mềm xử
lý thống kê SPSS (Statistical Program Scientific
System) 16.0.
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Hình thành cây con từ chồi ex vitro
Sau 2 tuần nuôi cấy, các chồi lớn dần và hình
thành cây con mang từ 2 - 4 lá/cây. Các lá này
được dùng làm vật liệu cho thí nghiệm tạo mô
sẹo.
Bảng 1. Sự hình thành mô sẹo và cấu trúc nhiều rễ của cây Cát tường sau 5 tuần nuôi cấy dưới ảnh hưởng
của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật và các điều kiện nuôi cấy.
CHẤT
ĐHSTTV
(mg/l)
Điều kiện tối
Cấu trúc nhiều rễ
Điều kiện sáng
Mô sẹo Cấu trúc nhiều rễ
Tỷ lệ
Mô sẹo
Tỷ lệ
Tỷ lệ
hình
thành
(%)
Tỷ lệ
hình
thành
(%)
α-
2,4-
hình
thành
(%)
Hình
thái
Hình
thái
hình
thành
(%)
Hình
thái
Hình
thái
NAA
D
0
1
0
0
0,00e*
0,00c
0,00d
0,00c
Vàng
trắng,
xốp
Trắng,
xốp
57,50c
0,00c
60,00c
0,00c
Trắng,
vàng,
Trắng
rễ
Vàng,
xanh,
Xanh,
trắng,
mảnh
1,5
2
0
0
90,83b
100a
9,17b
0,00c
91,67b
8,33b
0,00c
hạt, đặc
mảnh
hạt, đặc
Trắng,
Vàng,
100,00a
vàng,
xanh,
113
Journal of Science – 2016, Vol. 11 (3), 110 – 118 Part C: Agricultural Sciences, Fisheries and Biotechnology
CHẤT
ĐHSTTV
(mg/l)
Điều kiện tối
Cấu trúc nhiều rễ
Điều kiện sáng
Mô sẹo Cấu trúc nhiều rễ
Tỷ lệ
Mô sẹo
Tỷ lệ
Tỷ lệ
hình
thành
(%)
Tỷ lệ
hình
thành
(%)
α-
2,4-
hình
thành
(%)
Hình
thái
Hình
thái
hình
thành
(%)
Hình
thái
Hình
thái
NAA
D
hạt, đặc
hạt, đặc
Trắng
vàng,
Vàng,
xanh,
0
0
0,5
1
100,00a
50,00d
0,00c
100,00a
55,83c
0,00c
hạt, đặc
hạt, đặc
Vàng
xanh,
xốp
Xanh,
trắng,
rễ to
Trắng,
xốp
Trắng,
rễ to
47.50a
44,17a
Chú thích: *: Những chữ cái khác nhau (a, b, c,…) trong cùng một cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa với P<0,05 trong
Duncan’s test.
Đặc biệt, các mô sẹo hình thành ở nồng độ 2 mg/l
α-NAA hoặc 0,5 mg/l 2,4-D trong điều kiện có
chiếu sáng hay không cho mô sẹo có màu vàng,
dạng đặc. Quan sát mô học những mô sẹo này
dưới kính hiển vi cho thấy có nhiều tế bào đang
phân chia với những tế bào đẳng kính, nhân to
mang bản chất phôi. Vì vậy, có thể những mô sẹo
này có khả năng phát sinh phôi sinh dưỡng (Hình
2D, 2 E).
sẹo từ hạt hay kết quả tạo mô sẹo từ lá (bổ sung
vào môi trường B5 1,5 mg/l α-NAA của Hassan
và cs., 2014) thì kết quả nghiên cứu ở đây cần
phải bổ sung 2 mg/l α-NAA vào môi trường nuôi
cấy thì tỷ lệ hình thành mô sẹo đạt 100%. Có lẽ,
sự cảm ứng của mẫu cấy còn phụ thuộc vào chủng
loại.
Tuy việc sử dụng 2,4-D và α-NAA đều cho tỷ lệ
hình thành mô sẹo cao nhưng để đảm bảo độ ổn
định di truyền thì việc sử dụng α-NAA cho những
nghiên cứu tiếp theo là khả thi.
Tỷ lệ hình thành mô sẹo đạt cao nhất 100% trên
môi trường MS bổ sung 2 mg/l α-NAA hoặc 0,5
mg/l 2,4-D trong điều kiện có chiếu sáng hay tối
hoàn toàn. Ở các nồng độ CĐHSTTV cao hơn
như khi cảm ứng mẫu bằng 2,4-D (1 mg/l) đã xuất
hiện cấu trúc màu xanh hay trắng gồm nhiều rễ
bất định, rễ to (tỷ lệ: 44,17% – 55,83%) (Hình
2H). So với kết quả của Lutoslawa và cs. (1988)
sử dụng GA3 và kinetin để nuôi cấy hạt và tạo mô
3.3 Ảnh hưởng của các loại mẫu cấy lên tỷ lệ
hình thành mô sẹo của cây Cát tường
Chọn môi trường nuôi cấy MS bổ sung 2 mg/l α-
NAA để nuôi cấy các loại mẫu lá, lóng thân và
đoạn rễ của cây Cát tường, kết quả nhận được ở
Bảng 2.
Bảng 2. Sự hình thành mô sẹo của các loại mẫu của cây Cát tường sau 5 tuần nuôi cấy với việc bổ sung 2 mg/l α-
NAA vào môi trường nuôi cấy trong hai điều kiện có và không có chiếu sáng.
Loại mẫu
Lá
Tỷ lệ tạo mô sẹo trong điều kiện tối (%) Tỷ lệ tạo mô sẹo trong điều kiện sáng (%)
100,00a*
67,50b
0,00c
100,00a
68,33b
0,00c
Lóng thân
Đoạn rễ
Chú thích: *: Những chữ cái khác nhau (a, b, c,…) trong cùng một cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa với P<0,05 trong
Duncan’s test.
114
Journal of Science – 2016, Vol. 11 (3), 110 – 118 Part C: Agricultural Sciences, Fisheries and Biotechnology
Từ kết quả ở Bảng 2 cho thấy, tỷ lệ hình thành mô
sẹo đạt cao nhất ở loại mẫu cấy là lá (100%) trong
cả hai điều kiện nuôi cấy có và không có chiếu
sáng. Trong khi đó, loại mẫu cấy là đoạn rễ thì
không hình thành mô sẹo. Kết quả của Rezaee và
cs. (2012) khi cảm ứng mẫu lá, lóng thân và đoạn
rễ cũng cho kết quả khá tương tự, với việc bổ
sung BA (0,225 mg/l) lẫn α-NAA (1,86 mg/l) vào
môi trường nuôi cấy. Auxin như α-NAA kích
thích phân chia và kéo dài tế bào, kích thích các tế
bào phân chia không trật tự dẫn tới sự phát sinh
tạo mô sẹo. Cytokinin như BA giúp auxin phân
chia tế bào và hình thành chồi. Trong nghiên cứu
này, chỉ sử dụng 2 mg/l α-NAA là đủ để cảm ứng
hình thành mô sẹo từ lá. Sự phân chia các tế bào
biểu bì, nhu mô lá… thường dẫn đến các tế bào có
kích thước nhỏ, đẳng kính, tế bào chất đậm đặc và
nhân to là những tế bào có khả năng sinh phôi và
qua quan sát giải phẫu đã cho thấy điều này (Hình
2D). Vì vậy, nuôi cấy mẫu lá với việc bổ sung 2
mg/l α-NAA là thích hợp trong hình thành mô
sẹo.
3.4 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sự
phát triển của mô sẹo và cấu trúc nhiều rễ
Hai loại mô sẹo thu được: mô sẹo có màu trắng
xanh, xốp (mô sẹo 1, Hình 2B) và mô sẹo có màu
vàng, dạng hạt, đặc (mô sẹo 2, Hình 2C) và cấu
trúc nhiều rễ (Hình 2H) thu được từ thí nghiệm
(mục 3.2 và 3.3) được nuôi cấy tiếp tục trên môi
trường tương tự để khảo sát ảnh hưởng của thời
gian lên sự phát triển của những cấu trúc này. Kết
quả thu nhận được thể hiện qua Bảng 3.
Từ kết quả ở Bảng 3 cho thấy, khối lượng của cả
hai loại mô sẹo tăng dần theo thời gian nuôi cấy.
Khối lượng của chúng đạt cực đại sau 21 ngày
nuôi cấy. Khối lượng của dạng cấu trúc nhiều rễ
cũng tăng dần theo thời gian nuôi cấy với những
rễ phát triển to, dài, màu xanh hay trắng và đạt
cực đại sau 14 ngày nuôi cấy nhưng các cấu trúc
này không tiếp tục phát triển, một số thậm chí bị
hoại tử dẫn đến khối lượng giảm dần ở ngày nuôi
cấy thứ 21. Vì vậy, không chọn những cấu trúc
nhiều rễ này cho việc tái sinh hình thành cây.
Bảng 3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sự phát triển của các loại mô sẹo và cấu trúc nhiều rễ của cây Cát
tường.
Thời gian nuôi cấy
Khối lượng của mô sẹo
Khối lượng của mô
sẹo 2 (g)
Khối lượng của cấu
trúc nhiều rễ (g)
(ngày)
1 (g)
7
1,41c*
2,81b
4,64a
1,43c
2,50b
4,02a
1,55c
2,93a
2,07b
14
21
Chú thích: *: Những chữ cái khác nhau (a, b, c,…) trong cùng một cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa với P<0,05 trong
Duncan’s test.
3.5 Ảnh hưởng của BA lên sự phát sinh hình
thái của mô sẹo cây Cát tường
vùng trung tâm phân sinh để biệt hóa chồi. Ngược
lại, ở mô sẹo 2 cùng nồng độ BA 1 mg/l thì tỷ lệ
hình thành cây con là cao hơn cả (95%). Chứng
tỏ, mô sẹo 2 mang bản chất phát sinh phôi. Với sự
hỗ trợ của BA, một cytokinin đã giúp các phôi
non phát triển. Khác với mô phân sinh ngọn chồi,
phôi bị tách khỏi khối mô vẫn tiếp tục tăng trưởng
và phát triển bình thường trên môi trường thiếu
CĐHSTTV. Ở phôi còn quá non, chưa có khả
năng tổng hợp cytokinin, vì vậy, việc bổ sung
cytokinin như BA là cần thiết ở giai đoạn đầu.
Không những thế, BA phối hợp với auxin trong
mẫu mô sẹo giúp sự tăng trưởng chồi con và khởi
Từ kết quả ở các Bảng 4, Bảng 5 cho thấy ảnh
hưởng của BA lên sự phát sinh hình thái của mô
sẹo cây Cát tường. Khi không bổ sung BA, mô
sẹo tiếp tục tăng sinh với tỷ lệ đáng kể ở cả hai
loại mô sẹo. Điều này có lẽ là do sự chi phối của
α-NAA có trong mô sẹo. Khi tăng nồng độ BA, tỷ
lệ hình thành mô sẹo giảm dần cho đến 0% và
đồng thời, tỷ lệ hình thành chồi và cây con tăng
dần theo nồng độ tăng của BA. Ở mô sẹo 1, tỷ lệ
hình thành chồi đạt cao nhất ở nồng độ BA 1 mg/l
(93,33%). Điều này cho thấy mô sẹo 1 chứa các
115
Journal of Science – 2016, Vol. 11 (3), 110 – 118 Part C: Agricultural Sciences, Fisheries and Biotechnology
phát sự tạo mới mô phân sinh ngọn chồi từ nhu
mô (Bùi Trang Việt, 2000).
hình thành rễ và phát triển bình thường, nhưng ở
nồng độ 1 mg/l BA, tỷ lệ phát sinh chồi từ mô sẹo
là cao hơn (93,33%) nhưng chiều dài của các cây
này lại thấp (24,2 mm so với 17,34 mm; 28,50mm
so với 20,10 mm). Có lẽ, BA đã ức chế sự tăng
trưởng của chồi ngọn. Vì vậy, một nồng độ BA
0,5 mg/l là vừa đủ để hình thành chồi và cây con
từ hai loại mô sẹo này.
Chồi hình thành từ mô sẹo 1 đạt số lượng trung
bình 24 – 31 chồi/cụm mô sẹo có khối lượng
trung bình 1 g. Cây con hình thành từ mô sẹo 2
đạt số lượng trung bình 21 – 25 cây/cụm mô sẹo
có khối lượng trung bình 1 g. Kết quả này cũng
tương đương như công bố của Nhut và cs. (2006).
Tuy nhiên, cây con hình thành từ mô sẹo 2 là qua
con đường phát sinh phôi. Cây hình thành chồi, rễ
và phát triển hoàn chỉnh mà không cần phải sử
dụng IBA và GA3 như các công bố của Nhut và
cs. (2006); Hassan và cs. (2014).
Như vậy, cytokinin như BA đã ảnh hưởng rõ rệt
lên sự hình thành và phân hóa cơ quan của thực
vật, đặc biệt là sự phân hóa chồi và giúp phôi phát
triển. Ngoài ra, cytokinin còn có mối quan hệ
tương tác với auxin, cytokinin làm yếu hiện tượng
ưu thế ngọn, làm gia tăng sự phân cành.
Ngoài ra, ở nồng độ 0,5 mg/l BA thì mô sẹo hình
thành chồi (82,33%, Hình 2 G) và các chồi này
Bảng 4. Ảnh hưởng của BA lên sự phát sinh hình thái của loại mô sẹo 1 của cây Cát tường sau 4 tuần nuôi cấy trên
môi trường MS
Nồng
độ BA
(mg/l)
Tỷ lệ hình
thành mô
sẹo (%)
Tỷ lệ hình
thành chồi
(%)
Tỷ lệ hình
thành cây
con (%)
Chiều dài chồi
Chiều dài
rễ (mm)
Số rễ/cây
(mm)
0
0,5
1
54,17a*
7,50b
33,83c
82,50b
93,33a
12,00a
10,00a
6,67b
12,67c
24,20a
17,34b
20,33b
27,47a
20,53b
3,03b**
5,45,a
3,07c
0,00c
Chú thích: *: Những chữ cái khác nhau (a, b, c,…) trong cùng một cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa với P<0,05 trong
Duncan’s test.
**: Số rễ hình thành sau khi các chồi được chuyển sang môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l α-NAA để tạo rễ sau 2 tuần nuôi
cấy.
Bảng 5. Ảnh hưởng của BA lên sự phát sinh hình thái của loại mô sẹo 2 của cây Cát tường sau 4 tuần nuôi cấy trên
môi trường MS
Chiều dài
chồi
Nồng độ
BA
Tỷ lệ hình
thành mô
sẹo (%)
Tỷ lệ hình
thành chồi
(%)
Tỷ lệ hình
thành cây
con (%)
Chiều dài rễ
Số rễ/cây
(mm)
(mg/l)
(mm)
0
0,5
1
59,17a*
10,00b
0,00c
12,33a
5,83b
5,00b
28,50c
84,17b
95,00a
18,67b
21,33b
32,67a
20,67b
3,23b
5,05,a
3,67b
28,50a
20,10b
Chú thích: *: Những chữ cái khác nhau (a, b, c,…) trong cùng một cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa với P<0,05 trong
Duncan’s test.
Kết quả các số liệu từ hai Bảng 4 và Bảng 5 cho
thấy con đường phát sinh phôi sinh dưỡng từ mô
sẹo 2 là ưu thế hơn con đường phát sinh chồi từ
mô sẹo 1, vì từ phôi sinh dưỡng hình thành cây
con (Hình 2F) mà không cần các công đoạn như:
cắt, chuyển chồi sang môi trường mới để chồi ra
116
Journal of Science – 2016, Vol. 11 (3), 110 – 118 Part C: Agricultural Sciences, Fisheries and Biotechnology
rễ. Cụ thể, các chồi con hình thành từ mô sẹo 1
được chuyển sang môi trường MS bổ sung 0,5
mg/l α-NAA để hình thành rễ sau 2 tuần nuôi cấy
(và 100% các chồi này đều hình thành rễ và phát
triển thành cây hoàn chỉnh).
giống cao. Đây là sự ghi nhận về con đường nhân
giống nhanh và khả thi của cây Cát tường.
Những kết quả trên cho thấy, mẫu lá từ nuôi cấy
chồi là thích hợp hơn cả trong việc hình thành và
phát triển của cả hai loại mô sẹo 1 và 2 trên môi
trường MS bổ sung 2 mg/l α-NAA hoặc 0,5 mg/l
2,4-D. Mô sẹo 1 hình thành chồi, mô sẹo 2 hình
thành phôi sinh dưỡng và phát triển thành cây con
khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy 0,5 mg/l BA.
Các chồi từ mô sẹo 1 phát triển thành cây con khi
chuyển sang nuôi cấy trên môi trường MS bổ
sung 0,5 mg/l α-NAA. Các cây con đều sống sót
và thích nghi tốt trong điều kiện ex vitro.
Tất cả các cây con được chuyển sang trồng trong
nhà kính và đã thích nghi tốt trong điều kiện ex
vitro (Hình 2I). Không phát hiện các thay đổi bất
thường nào về hình thái của các cây con này qua
hai con đường nhân giống này.
Quan sát mô học
Các quan sát giải phẫu hình thái mô sẹo sau 5 tuần
nuôi cấy mẫu lá cho thấy, có nhiều tế bào nhỏ,
đẳng kính, nhân to, đang phân chia mạnh mẽ. Đây
là những tế bào có khả năng hình thành phôi
(Hình 2D). Nuôi cấy tiếp tục những mô sẹo này
thêm 2 tuần, chúng đã hình thành các phôi sinh
dưỡng, nhô lên từ khối mô sẹo (Hình 2E). Vì vậy,
những mô sẹo này là loại mô sẹo có khả năng phát
sinh phôi.
4.2 Khuyến nghị
Các cây con cần được nuôi trồng tiếp tục để khảo
sát khả năng sinh trưởng và cho hoa của cây Cát
tường.
LỜI CẢM ƠN
Tác giả trân trọng cảm ơn Trường Cao đẳng Kinh
tế Kỹ thuật Lâm Đồng đã tạo điều kiện về cơ sở
vật chất cho nghiên cứu này.
4. KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ
4.1 Kết luận
Qua hai con đường hình thành chồi và hình thành
phôi sinh dưỡng, tạo cây con từ mô sẹo cho thấy,
dù bằng con đường nào thì đều có khả năng nhân
Hình 2. Vi nhân giống cây Cát tường
117
Journal of Science – 2016, Vol. 11 (3), 110 – 118 Part C: Agricultural Sciences, Fisheries and Biotechnology
A. Mẫu cành hoa cây Cát tường (thanh ngang = 2,8 cm).
B. Mô sẹo 1 sau 6 tuần nuôi cấy mẫu lá (thanh ngang = 1 cm).
C. Mô sẹo 2 sau 6 tuần nuôi cấy mẫu lá (thanh ngang = 1 cm).
D. Sự phân chia của các tế bào trong mô sẹo 2 sau 7 tuần nuôi cấy (thanh ngang = 30 µm).
E. Sự hình thành phôi sinh dưỡng (mũi tên) trên mẫu mô sẹo 2 (thanh ngang = 300 µm).
F. Sự hình thành cây con từ mô sẹo 2 (thanh ngang = 1 cm).
G. Sự hình thành chồi từ mô sẹo 1 (thanh ngang = 1 cm).
H. Sự hình thành cấu trúc nhiều rễ bất định sau 6 tuần nuôi cấy (thanh ngang = 1 cm).
I. Sự ra rễ và phát triển của cây con trong nhà kính (thanh ngang = 2,5 cm).
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Murashige, T., & Skoog, F. (1962). A revised
medium for rapid growth and bioassay with
tobacco cultures. Physiology Plant, 15, 73-97.
Nhut, D.T., Tuan, N.S., Ngoc, H.M., Uyen, P.N.,
Don, N.T., Mai, N.T…, da Silva, J.A.T.
(2006). Somatic embryogenesis induction
from in vitro leaf cultures of Lisianthus
(Eustoma grandiflorum (RAF.) Shinn.).
Propagation Ornament Plants, 6(3), 121-127.
Bùi Trang Việt. (2000). Sinh lý thực vật đại
cương, tập 2. Hồ Chí Minh: Nhà xuất bản Đại
học Quốc Gia.
Furukawa, H. (1993). Some characteristics of
regenerated plants from leaf and root explants
of Eustoma grandiflorum. Plant Tissue
Culture Letter, 10(1), 98-99.
George, E.F., Hall, M.A. & Klerk, G.J. (2008).
Plant propagation by tissue culture, Volume I.
The Netherlands: Springer, 175-354.
Rezaee, F, Ghanati, F., & Yusefzadeh Boroujeni,
L. (2012). Micropropagation of Lisianthus
(Eustoma grandiflora L.) from different
explants to flowering onset. Iranian Journal of
Plant Physiology, 3(1), 583-587.
Hassan, A., Reyhaneh, P., & Narges, K. (2014).
Evaluating the micropropagation of Lisianthus
(Eustoma grandiflora l.) as an important
ornamental. Plant Indian Journal of Science, 4
(2), 596-602.
Ruffoni, B., Damiano, C., Massabo, F., &
Esposito, P. (1990). Organogenesis and
embryogenesis in Lisianthus russellianus
Hook. Acta Horticulture, 280, 83-87.
Linsmaier, E.M., & Skoog, F. (1965). Organic
growth factor requirement of tobacco tissue
cultures. Physiology Plant, 18, 100-127.
Semeniuk, P., & Griesbach, R.J. (1987). In vitro
propagation of Prairie gentian. Plant Cell,
Tissue and Organ Culture, 8(3), 249-253.
Lutoslawa, S., Maria, W., & Barbara, T. (1988).
Callus culture and micropropagation Eustoma
grandiflorum Shinn. Acta Societatic, 57 (4),
423-430.
118
9 trang
08/01/2024
20520
Free
Bạn đang xem tài liệu "Nhân giống cây cát tường (Eustoma Grandiflorum L.) qua hai con đường phát sinh phôi sinh dưỡng và phát sinh cơ quan", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên
File đính kèm:
- nhan_giong_cay_cat_tuong_eustoma_grandiflorum_l_qua_hai_con.pdf
