Phát hiện các loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt bằng phản ứng chuỗi Polymerase

Vietnam J. Agri. Sci. 2018, Vol. 16, No. 12: 1025-1038

Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 2018, 16(12): 1025-1038

www.vnua.edu.vn

PHÁT HIỆN CÁC LOÀI Colletotrichum GÂY BỆNH THÁN THƯ ỚT

BẰNG PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE

Nguyễn Duy Hưng^1*, Hà Viết Cường², Hoàng Chúng Lằm¹

¹Viện nghiên cứu Rau quả, ²Khoa Nông học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

^*Tác giả liên hệ: duyhungfavri@gmail.com

Ngày nhận bài: 21.01.2019

Ngày chấp nhận đăng: 19.02.2019

TÓM TẮT

Bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. là một trong các bệnh nguy hiểm nhất trên ớt tại Việt Nam và thế

giới. Định danh loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt dựa trên các đặc điểm hình thái thường gây ra sự nhầm lẫn.

Mục tiêu của nghiên cứu là thiết kế được các cặp mồi đặc hiệu phục vụ chẩn đoán nhanh, chính xác loài nấm

Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR. Trong nghiên cứu này dựa trên trình tự

vùng Internal Transcribed Spacer (ITS) và vùng liên gen của 2 gen apn2 và MAT1-2-1 genes (ApMat) đã thiết kế

được 4 cặp mồi đặc hiệu. Các cặp mồi thiết kế đã phát hiện đặc hiệu 4 loài C. truncatum, C. fructicola, C.

gloeosporioides sensu stricto và C. siamense gây bệnh thán thư ớt tại đồng bằng sông Hồng và một số tỉnh. Nghiên

cứu cũng chứng tỏ phương pháp chiết nhanh DNA bằng NaOH có hiệu quả cao nhằm chuẩn bị mẫu DNA từ nấm

Colletotrichum cho phản ứng PCR. Phân tích PCR dùng các mồi đặc hiệu trên 52 mẫu nấm Colletotrichum gây bệnh

thán thư ớt thu tại 9 tỉnh đồng bằng Sông Hồng, 3 tỉnh trung du và miền núi phía Bắc và 1 tỉnh đồng bằng Sông Cửu

Long đã xác định được loài phổ biến nhất là C. siamense (chiếm 51,9% tổng số mẫu), tiếp theo là C. fructicola

(21,2%), C. truncatum (15,4%), và C. gloeosporioides sensu stricto (9,6%).

Từ khóa: Bệnh thán thư ớt, Colletotrichum, chẩn đoán, mồi đặc hiệu, PCR.

Detection of Colletotrichum Species Causing Anthracnose of Chili

by Polymerase Chain reaction

ABSTRACT

Anthracnose caused by Colletotrichum spp. is one of the most destructive diseases of chili in Vietnam and

worldwide. Identifying Colletotrichum species that cause anthracnose based on morphological characteristics often

causes confusion. The objective of the study was to design specific primer pairs for rapid and accurate diagnosis of

Colletotrichum fungus causing anthracnose by PCR (polymerase chain reaction). In the study, based on the Internal

Transcribed Spacer (ITS) region and the intergenic region of apn2 and MAT1-2-1 genes (ApMat) four specific primer

pairs were designed. Four species,i.e. C. truncatum, C. fructicola, C. gloeosporioides sensu stricto and C. siamense

that cause chili anthracnose in the Red River Delta and some other provinces were detected. The study also showed

that a modified rapid extraction protocol using NaOH was highly effective to prepare DNA samples from

Colletotrichum cultures for PCR reaction. PCR analyses using the newly designed specific primers on 52 chili

Colletotrichum isolates collected from 13 provinces, mainly the Red River Delta, revealed C. siamense as the most

abundant species (51.9% of total isolates), followed by C. fructicola (21.2%), C. truncatum (15.4%), and C.

gloeosporioides sensu stricto (9.6%).

Keywords: Colletotrichum, chili, specific primer design, diagnosis, PCR.

loài Colletotrichum gây bệnh thán thā ĉt công

1. ĐẶT VẤN ĐỀ

bø trên thế giĉi khá đa däng, bao g÷m ít nhçt 7

Trong sø các bệnh häi ĉt, bệnh thán thā do

nçm Colletotrichum spp. gåy ra đāČc xem là

nguy hiểm nhçt. Cho tĉi nëm 2008, thành phæn

loài C. gloeosporioides, C. capsici, C. acutatum,

C. coccodes, C. dematium, C. nigrum và

C. atramentarium (Than et al., 2008). Täi Việt

1025

Phát hiện các loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt bằng phản ứng chuỗi polymerase

Nam, ít nhçt

4

loài là C. acutatum,

Xác đðnh chính xác thành phæn cÿng nhā

đðnh danh đýng nçm Colletotrichum có vai trò

quan trõng không nhąng về mặt khoa hõc mà

còn trong thĆc tiễn quân lý bệnh vì quan hệ

giąa nçm vĉi cây ký chþ cÿng nhā tính mén

câm vĉi thuøc hóa hõc khác nhau theo loài

(Mongkolporn et al., 2010; Peres et al., 2004).

C. capsici, C. gloeosporioides, C. nigrum đã đāČc

công bø gây bệnh thán thā ĉt (Don et al., 2007;

Ngô Bích Hâo, 1992).

Đðnh danh nçm Colletotrichum dĆa vào các

đặc điểm hình thái thāĈng khöng đþ để phân

loäi tĉi măc loài nên đã cò quá nhiều nhæm lén

trong phân loäi chi nçm này (Hyde et al., 2009).

Gæn đåy, đðnh danh nçm Colletotrichum dĆa

trên phân tích phân tĄ ngày càng phù biến và

dén tĉi nhiều thay đùi trong phân loäi các loài

thuûc chi này (Cannon et al., 2012).

Do xác đðnh các loài Colletotrichum dĆa

trên các đặc điểm hình thái thāĈng mçt thĈi

gian nên kỹ thuêt PCR đã đāČc áp dĀng. Nhiều

cặp m÷i PCR đã đāČc thiết kế để phát hiện các

loài Colletotrichum gây häi trên ĉt (Imjit et al.,

2012; Srinivasan et al., 2014) cÿng nhā các các

cây tr÷ng khác (Kamle et al., 2013; Torres-

Calzada et al., 2011; Shi et al., 2008; Yao et al.,

2018). Tuy nhiên, các cặp m÷i này đều đāČc

thiết kế trên vùng ITS vøn bâo thþ cao nên khó

có thể phân biệt đāČc các loài, đặc biệt trong các

phăc hČp loài nhā C. gloeosporioides sensu lato.

Đøi vĉi nçm Colletotrichum gây bệnh thán

thā trên ĉt, các nghiên cău phân loäi mĉi gæn

đåy cho thçy có sĆ thay đùi lĉn về thành phæn

loài so vĉi các công bø trāĉc đåy. Täi Ấn Đû,

đðnh danh läi 52 méu nçm C. gloeosporioides

sensu lato cho thçy chúng thuûc 2 loài là

C. fructicola vàC. siamense (Sharma & Shenoy,

2013). Tāćng tĆ, 2 loài C. acutatum và

C. capsici, vøn đāČc coi là 2 loài chính gây häi

trên ĉt täi Thái Lan nay đāČc đðnh danh läi læn

lāČt là C. simmondsii và C. truncatum (Ko et

al., 2011). Cÿng täi Thái Lan, gæn đåy hćn 4 loài

Colletotrichum gây bệnh thán thā ĉt đã đāČc

xác đðnh là C. gloeosporioides sensu stricto,

C. siamense, C. acutatum và C. truncatum

(Suwannarat et al., 2017). Täi Trung Quøc,

phân tích trình tĆ cþa 1285 méu nçm

Colletotrichum thu täi 29 tînh đã xác đðnh đāČc

15 loài trong đò cò 5 loài phù biến là

C. fioriniae, C. fructicola, C. gloeosporioides

sensu stricto , C. scovillei, and C. truncatum

(Diao et al., 2017). Täi Úc, phân tích 45 méu

nçm Colletotrichum gây bệnh thán thā ĉt đã xác

đðnh đāČc 5 loài C. siamense, C. simmondsii,

MĀc tiêu cþa nghiên cău này là thiết kế các

cặp m÷i đặc hiệu cho múi loài Colletotrichum

phát hiện đāČc trên ĉt täi Việt Nam, chþ yếu täi

đ÷ng bìng sông H÷ng, và ăng dĀng chýng để

phát hiện và đánh giá măc đû phù biến cþa các

loài Colletotrichum gây bệnh thán thā trên ĉt.

2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. Mẫu nấm

Các méu nçm Colletotrichum đāČc phân lêp

tĂ vết bệnh thán thā trên quâ ĉt thu thêp tĂ

nëm 2015-2017. Bào tĄ trên vết bệnh đāČc hòa

trong nāĉc cât vô trùng và cçy ria 3 chiều trên

möi

trāĈng

WA

(Water

Agar)

chăa

Streptomycin (100 ppm). Méu nçm thuæn đāČc

täo ra bìng cách cçy truyền tân nçm đćn (tĂ 1

bào tĄ) tĂ möi trāĈng WA sang möi trāĈng PDA

(Potato Dextrose Agar).

C.

queenslandicum,

C.

truncatum

và

C. cairnsense (De Silva et al., 2017).

Trong nëm 2017, dĆa trên đặc điểm hình

thái và giâi trình tĆ vùng Internal Transcribed

Spacer (ITS) và vùng liên gen cþa 2 gen apn2 và

MAT1-2-1 (ApMat) cþa các méu Colletotrichum

gây bệnh thán thā ĉt thu täi đ÷ng bìng sông

2.2. Thiết kế mồi PCR

Để thiết kế m÷i đặc hiệu, trình tĆ các méu

đäi diện cho các loài Colletotrichum (Type

species) đāČc tâi tĂ Genbank và đāČc cën trình

tĆ đa chuúi bìng phæn mềm CLUSTAL X

version 2.1 (Larkin et al., 2007). DĆa trên các

trình tĆ đāČc cën trình tĆ đa chuúi, các m÷i đāČc

lĆa chõn tĂ các trình tĆ đặc hiệu cho múi loài.

H÷ng, ít nhçt

5

loài là C. truncatum,

C. fructicola, C. gloeosporioides sensu stricto,

C. aeschynomenes, C. siamense đã đāČc xác

đðnh (Nguyễn Duy Hāng và cs., 2017).

1026

Nguyễn Duy Hưng, Hà Viết Cường, Hoàng Chúng Lằm

2.4. Phản ứng PCR

Đøi vĉi loài C. truncatum, m÷i đặc hiệu

đāČc thiết kế trên vùng ITS vì vùng này chăa

nhiều vð trí khác biệt đặc trāng cho loài này

(Nguyễn Duy Hāng và cs., 2017). Vùng ITS cþa

loài này đã đāČc cën trình tĆ đa chuúi vĉi 7 loài

Colletotrichum đã đāČc công bø gây bệnh thán

thā ĉt (Than et al., 2008).

Đøi vĉi 3 loài C. gloeosporioides sensu

stricto, C. siamense và C. fructicola cþa phăc

hČp loài C. gloeosporioides sensu lato, do trình

tĆ ITS cþa chúng quá bâo thþ, nên trình tĆ

vùng ApMat (Silva et al., 2012) đã đāČc sĄ dĀng

để thiết kế m÷i đặc hiệu. Trình tĆ ApMat cþa 28

loài thuûc phăc hČp loài C. gloeosporioides

sensu lato (Liu et al., 2015) đã đāČc lĆa chõn để

cën trình tĆ đa chuúi.

Các phân ăng PCR đāČc thĆc hiện bìng kít

GoTaq Green Master Mix (Promega) hoặc kít 2X

i-Taq PCR Master Mix (iNtRON Biotechnology).

Phân ăng PCR đāČc thĆc hiện vĉi điều kiện sau:

khĊi đæu biến tính Ċ 94C trong 2 phút; tiếp

theo là 35 chu trình phân ăng g÷m biến tính Ċ

94C trong 30 giây, gín m÷i Ċ 54-62C trong 30

giåy (thay đùi theo thí nghiệm và m÷i), tùng hČp

sČi Ċ 72C trong 1 phút. Phân ăng đāČc kết thúc

vĉi 5 phút Ċ 72C.

Sân phèm PCR đāČc điện di trên gel

agarose 1% đã chuèn bð bìng đệm TAE (Tris

Acetic acid EDTA) và chăa 0,5 mg/mL ethidium

bromide. Gel đāČc chäy trên thiết bð điện di

Mupid-exU Mini System (Helixxtec) vĉi đệm

TAE Ċ điện thế 100 V trong 30-40 phút.

Các méu Colletotrichum düng để tøi āu

hóa các m÷i thiết kế trong phân ăng PCR là các

méu nçm phân lêp tĂ ĉt và đã xác đðnh danh

tính (Nguyễn Duy Hāng và cs., 2017) bao g÷m

C. truncatum (méu C25 và C30), C. fructicola

(méu C1 và C14), C. siamense (méu C4 và C33),

C. gloeosporioides (sensu stricto) (méu C9 và

C44), C. aeschynomenes (méu C29).

3. KẾT QUÂ VÀ THÂO LUẬN

3.1. Thiết kế mồi đặc hiệu loài

Colletotrichum

DĆa trên so sánh trình tĆ, bøn cặp m÷i đặc

hiệu cho 4 loài C. truncatum, C. gloeosporioides

sensu stricto, C. siamense và C. fructicola đã

đāČc thiết kế. Mût loät các tham sø liên quan

đến chçt lāČng cþa m÷i cÿng đã đāČc xác đðnh

dĆa theo các hāĉng dén về thiết kế m÷i PCR

(Dieffenbach et al., 1993; Rychlik, 1993;

Judelson, 2006) (Bâng 1).

2.3. Chiết DNA nấm

DNA tùng sø cþa các méu nçm đāČc chiết

bìng 2 phāćng pháp.

Phāćng pháp 1 (CTAB) sĄ dĀng đệm CTAB

(cetyltrimethylammonium bromide) theo qui

trình cþa Doyle & Doyle (1987). Khoâng 50 mg

tân nçm thuæn nuôi cçy trên möi trāĈng PDA

đāČc nghiền bìng chày nhĆa chuyên dĀng

(Kontes™ Pellet Pestle) vĉi 0,5 mL đệm CTAB

trong øng Eppendorf loäi 1,5 mL. DNA đāČc

chiết mût læn vĉi Chloroform: isoamyl alcohol

(24:1). Cặn DNA đāČc rĄa hai læn bìng ethanol

70% và hña trong 30 uL nāĉc cçt 2 læn vô trùng.

Méu DNA đāČc bâo quân Ċ -20°C.

Đû dài m÷i: Các m÷i cò kích thāĉc 17-22

nucleotit. Các kích thāĉc này nìm trong phäm

vi phù hČp cþa m÷i: đþ dài để đâm bâo tính đặc

hiệu và đþ ngín để m÷i gín đễ dàng vào khuôn.

Nhiệt đû tách sČi (Tm): Hai cặp m÷i C.sia-

F1/-R1 và C.glo-F/-R có nhiệt đû tách chuúi tĂ

51,6-53,8C, nìm trong phäm vi phù hČp 50-

60C. Hai cặp m÷i còn läi, C-tru-F-/R và C.fru-

F1/-R1 có nhiệt đû tách sČi thçp hćn tĂ 41,2-

49C (Bâng 1).

Phāćng pháp 2 (NaOH) là phāćng pháp

chiết nhanh bìng NaOH đāČc câi tiến theo

phāćng pháp cþa Wang et al. (1993). Tân nçm

thuæn (khoâng 50 mg) trên möi trāĈng PDA đāČc

cho vào øng Eppendorf 1,5 mL chăa 50 µL NaOH

0,5 M và đāČc nghiền bìng đæu tip loäi 100-200

µL. Dðch nghiền, 5 µL, đāČc chuyển sang øng

Eppendorf 1,5 mL chăa 50 µL đệm Tris 0,1M, pH

8. Méu DNA đāČc bâo quân Ċ -20°C.

Nhiệt đû gín m÷i (Ta): Nhiệt đû gín m÷i là

mût trong các tiêu chí quan trõng, đāČc tính dĆa

trên nhiệt đû tách sČi. Nhiệt đû gín m÷i quá cao

làm m÷i khó gín vào khuôn dén tĉi nëng suçt

PCR thçp. Nhiệt đû gín m÷i quá thçp làm m÷i

dễ gín khöng đặc hiệu vào khuôn dén tĉi täo các

sân phèm khöng đặc hiệu. Mût trong các công

1027

Phát hiện các loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt bằng phản ứng chuỗi polymerase

thăc phù biến nhçt nhìm xác đðnh nhiệt đû gín

m÷i tøi āu cþa cặp m÷i là: Ta = 0,3 × Tm (cþa

m÷i có nhiệt đû tách sČi thçp hćn) + 0,7 Tm (cþa

sân phèm) -14,9 (Rychlik et al., 1990). SĄ dĀng

công thăc này trong phæn mền PrimerSelect

(DNASTAR Inc.), nhiệt đû gín m÷i tøi āu cþa 4

cặp m÷i thiết kế đāČc xác đðnh là tĂ 53-55,9C

(Bâng 1), nìm trong phäm vi phù hČp 50-60C.

3.2. Xác định nhiệt độ gắn mồi phù hợp cho

bốn cặp mồi thiết kế

Mût trong các yếu tø quan trõng ânh hāĊng

đến tính đặc hiệu và hiệu suçt cþa m÷i là nhiệt

đû gín m÷i. Mặc dù nhiệt đû gín m÷i tøi āu cho

4 cặp m÷i đã đāČc xác đðnh bìng phæn mềm

(Bâng 1) nhāng chýng cæn phâi đāČc xác đðnh

bìng thĆc nghiệm. SĄ dĀng DNA đāČc chiết tĂ

các méu nçm đã đāČc xác đðnh danh tính, phân

ăng PCR đã đāČc thĆc hiện Ċ 3 ngāċng nhiệt đû

là 54, 58 và 62C nhìm xác đðnh nhiệt đû gín

m÷i phù hČp cho 4 cặp m÷i thiết kế. Kết quâ

kiểm tra PCR (Bâng 2, Hình 1) cho thçy:

Hàm lāČng GC: Hàm lāČng các gøc

G và C cþa các m÷i thiết kế tĂ 42,9-57,9% (Bâng

1) nìm trong phäm vi phù hČp 40-60%.

Mçu GC đæu 3’: Tçt câ 7 m÷i thiết kế ngoäi

trĂ m÷i C.sia-R1 đều có Ċ đæu 3’ là G hoặc C

hoặc GC hoặc CG hoặc GG (Bâng 1). Mçu GC

cho phép m÷i bám đặc hiệu vào khuôn.

Cặp m÷i C.tru-F và C.tru-R (đặc hiệu loài

C. truncatum) có khâ nëng phát hiện đặc hiệu

loài này Ċ phäm vi nhiệt đû rçt rûng. Ở câ 3

ngāċng nhiệt đû, cặp m÷i này chî täo bëng sân

phèm mong muøn 321 bp đøi vĉi 2 méu C30 và

C25 (C. truncatum).

Đû ùn đðnh đæu 3’: Khoâng 5 nucleotit

(pentamer) đæu 3’ cæn cò đû ùn đðnh phù hČp để

gín đặc hiệu vào khuôn. Giá trð G cþa 5

nucleotit đæu 3’ cþa tçt câ các m÷i thiết kế có

giá trð tĂ -10,5 kcal/mol đến -7,1 kcal/mol

(Bâng 1), nìm trong ngāċng giĉi hän tøi đa

≥-12 kcal/mol.

Tāćng tĆ, cặp m÷i C.glo-F và C.glo-R (đặc

hiệu loài C. gloeosporioides sensu stricto) cÿng

có khâ nëng phát hiện đặc hiệu loài nçm này Ċ

câ 3 ngāċng nhiệt đû, chî täo bëng sân phèm

mong muøn 211 bp đøi vĉi 2 méu C9 và C44

(C. gloeosporioides sensu stricto).

Cçu trúc thă cçp: Cçu trúc thă cçp có thể

hình thành trong cùng mût m÷i hoặc giąa 2 m÷i.

M÷i chăa cçu trúc thă cçp xçu thāĈng dén tĉi

nëng suçt PCR bð giâm, thêm chí không có sân

phèm. Tính ùn đðnh cþa cçu trúc thă cçp đāČc

đo bìng nëng lāČng tĆ do Gibbs G (nëng lāČng

cæn để phá vċ cçu trúc thă cçp). Các loäi cçu

trúc thă cçp là:

Đøi vĉi cặp m÷i C.fruc-F1 và C.fruc-R1

(đặc hiệu loài C. fructicola), Ċ nhiệt đû gín m÷i

54C, bëng đặc hiệu 307 bp mặc dù chî hình

thành Ċ 2 méu C1 và C14 (C. fructicola) nhāng

mĈ, có lẽ do hình thành nhiều sân phèm tĆ m÷i

hoặc tĆ m÷i chéo (dimer). Ngoài ra, Ċ ngāċng

nhiệt đû này, cặp m÷i cÿng täo sân phèm

khöng đặc hiệu ~ 800 bp đøi vĉi méu C29

(C. aeschynomenes) và ~ 150 bp đøi vĉi méu

C25 (C. truncatum). Ở nhiệt đû gín m÷i 58C,

cặp m÷i đã täo bëng đặc hiệu rô đøi vĉi 2 méu

C1 và C14 (C. fructicola) chăng tó măc đû hình

thành dimer đã giâm. Tuy nhiên, Ċ ngāċng

nhiệt đû 58C, cặp m÷i cÿng täo bëng sân

phèm đặc hiệu rçt mĈ đøi vĉi méu C44

(C. gloeosporioides sensu stricto). Khi tëng

nhiệt đû lên 62C, cặp m÷i này chî täo bëng đặc

hiệu và rô đøi vĉi 2 méu C1 và C14 và không

täo bçt kč bëng sân phèm nào đøi vĉi các méu

Colletotrichum khác.

+ Cçu trúc kẹp tóc (Hairpins). Là cçu trúc

thă cçp hình thành trong nûi bû m÷i. Tçt câ các

m÷i thiết kế đều có giá trð G tøi đa tĂ -3

kcal/mol đến 2 kcal/mol (Bâng 1), nìm trong

ngāċng giĉi hän tøi đa ≥-5 kcal/mol.

+ TĆ m÷i (Self Dimer). Là cçu trúc hình

thành giąa các phân tĄ cþa cùng loäi m÷i. Tçt

câ các m÷i thiết kế đều có giá trð G tøi đa tĂ -

5,9 kcal/mol đến 0,3 kcal/mol (Bâng 1), nìm

trong ngāċng giĉi hän tøi đa ≥-6 kcal/mol.

+ TĆ m÷i chéo (Cross Dimer). Là cçu trúc

hình thành giąa các phân tĄ cþa 2 m÷i khác

nhau (cặp m÷i trong phân ăng PCR). Tçt câ các

m÷i thiết kế đều có giá trð G tøi đa tĂ -0,4

kcal/mol đến -0,2 kcal/mol (Bâng 1), nìm trong

ngāċng giĉi hän tøi đa ≥-6 kcal/mol.

1028

Nguyễn Duy Hưng, Hà Viết Cường, Hoàng Chúng Lằm

Bảng 1. Đặc điểm 4 cặp mồi được thiết kế để phát hiện C. truncatum, C. fructicola,

C. siamense và C. gloeosporioides sensu stricto

Nhiệt độ

gắn mồi

tối ưu (C)

Độ dài

mồi

(nu)

Độ dài

sản phẩm

(bp)

G pentamer

đầu 3'

(kcal/mol)

G cấu trúc G tự mồi G tự mồi

Nhiệt độ

tách mồi (C)

Mấu GC Hàm lượng

Mồi

Trình tự (5’-3’)

kẹp tóc tối đa

tối đa

chéo tối đa

đầu 3’

GC (%)

(kcal/mol)

(kcal/mol) (kcal/mol)

C.tru-F

C.tru-R

GTCCCCTAAAAAGGACGTC

CCTACGTCAACCGTAGAG

19

18

21

19

22

21

C

G

52,6

55,6

42,9

47,6

57,9

45,5

52,4

47,6

47,7

42,2

49,0

48,2

52,8

51,6

53,8

52,5

-9,4

-7,1

-9,9

-8,2

-9

-1,9

-3,1

1,1

1,2

0,8

2

-4,4

-2,5

-2,8

0,3

-2,9

-0,2

-0,4

-2

53

321

307

345

211

C.fruc-F1 CATCAAATCGAAGATCTCTGC

C.fruc-R1 CTTTAGGTCGTCCTTGTGTTC

GC

C

55,3

54,2

55,9

C.sia-F1

C.sia-R1

C.glo-F

C.glo-R

TGACAGCGGCTGTGTATCG

GATACTTAGGCGTACGAATGCA

ACTCTTGCCGCAGCATATAGG

GTAGCATCAGCAACGAATTGG

CG

Không

GG

-3

-10,5

-8,1

-10,4

-5,9

-0,1

-0,4

0,8

2

Ghi chú: Các tham số nhiệt động học của mồi gồm nhiệt độ tách mồi, G pentamer đầu 3’, G cấu trúc kẹp tóc tối đa, G tự mồi tối đa và G tự mồi chéo tối đa

được xác định dùng phần mềm VectorNTI Advance 11.5 (Invitrogen), trong đó G là năng lượng tự do Gibbs. Nhiệt độ gắn mồi tối ưu được xác định bằng phần

mềm PrimerSelect (DNASTAR, Inc.).

1029

Phát hiện các loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt bằng phản ứng chuỗi polymerase

Bảng 2. Xác định nhiệt độ gắn mồi phù hợp của 4 cặp mồi thiết kế

Băng PCR đặc hiệu ở các ngưỡng nhiệt độ

Cặp mồi

C.tru-F/-R

Loài nấm kiểm tra

54C

58C

62C

C. truncatum

++

+++

C. fructicola

-

C. siamense

-

C. gloeosporioides sensu stricto

C. aeschynomenes

C. truncatum

-

C.fruc-F1/-R1

C.sia-F1/-R1

C.glo-F/-R

-

C. fructicola

+

+++

C. siamense

-

C. gloeosporioides sensu stricto

C. aeschynomenes

C. truncatum

-

+++

-

+

-

C. fructicola

-

C. siamense

+++

C. gloeosporioides sensu stricto

C. aeschynomenes

C. truncatum

-

C. fructicola

-

C. siamense

-

+++

-

+++

-

C. gloeosporioides sensu stricto

C. aeschynomenes

++

-

Chú thích: (-): không xuất hiện băng đặc hiệu; (+, ++, +++): mức độ đậm của băng đặc hiệu

Ghi chú: Mũi tên chỉ băng sân phẩm mong muốn cho từng cặp mồi. Các giếng là các mẫu nấm đã xác định danh

tính: C25 và C30 (C. truncatum), C1 và C14 (C. fructicola), C4 và C33 (C. siamense), C9 và C44 (C. gloeosporioides

sensu stricto), C29 (C. aeschynomenes).

Hình 1. PCR xác định nhiệt độ gắn mồi phù hợp cho 4 cặp mồi đặc hiệu Colletotrichum

1030

Nguyễn Duy Hưng, Hà Viết Cường, Hoàng Chúng Lằm

Đøi vĉi cặp m÷i C.sia-F1 và C.sia-R1 (đặc

hiệu loài C. siamense), phân ăng PCR Ċ nhiệt đû

gín m÷i 54C đã täo bëng đặc hiệu 345 bp vĉi

tçt câ các méu nçm. Ở nhiệt đû gín m÷i 58C,

cặp m÷i này đã täo bëng đặc hiệu rô đøi vĉi 2

méu C4 và C33 (C. siamense) và rçt mĈ đøi vĉi

méu C30 (C. truncatum). Ở ngāċng nhiệt đû

58C, cặp m÷i cÿng täo bëng sân phèm không

đặc hiệu đøi vĉi méu C1 (C. fructicola) và C44

C. gloeosporioides sensu stricto). Khi tëng nhiệt

đû gín m÷i lên 62C, cặp m÷i này đã täo bëng

đặc hiệu, rõ đøi vĉi 2 méu C4 và C33

(C. siamense). Ở nhiệt đû gín m÷i 62C, cặp m÷i

vén täo bëng khöng đặc hiệu đøi vĉi méu C1

(C. fructicola), tuy nhiên bëng này cò thể phân

biệt đāČc vĉi bëng đặc hiệu.

dðch nghiền nçm Colletotrichum trong NaOH

chî đāČc hòa loãng 11 læn trõng đệm Tris, và do

đò làm tëng n÷ng đû DNA cþa méu chiết. Kết

quâ so sánh phân ăng PCR giąa 2 phāćng pháp

cÿng chăng tó nçm Colletotrichum không täo

các chçt ăc chế phân ăng PCR và đû hòa loãng

thçp cþa dðch NaOH trong đệm Tris không làm

thay đùi n÷ng đû ion Na⁺và pH tĉi măc ânh

hāĊng tĉi hiệu suçt phân ăng PCR.

DĆa trên kết quâ nghiên cău, phāćng pháp

chiết nhanh bìng NaOH cait tiến hoàn toàn phù

hČp để chiết DNA tĂ méu nçm Colletotrichum

cho phân ăng PCR. Phāćng pháp cò nhiều āu

điểm nhāng rçt đćn giân, nhanh, rẻ và giâm

thiểu nguy cć nhiễm chéo giąa các méu.

3.3. Xác định thành phần loài Colletotrichum

gây bệnh thán thư ớt bằng PCR

DĆa trên các kết quâ trên, nhiệt đû gín m÷i

tøi āu đøi vĉi 3 cặp m÷i C.tru-F/-R, C.fru-F1/-

R1 và C.glo-F/-R là tĂ 58-62C, đøi vĉi cặp m÷i

C.sia-F1/-R1 là 62C.

Sau khi xác đðnh đāČc nhiệt đû gín m÷i phù

hČp cho 4 cặp m÷i thiết kế và phāćng pháp chiết

DNA tøi āu tĂ méu nçm Colletotrichum, phân

ăng PCR đã đāČc thĆc hiện trên 52 méu nçm

Colletotrichum gây bệnh thán thā ĉt thu täi 9

tînh đ÷ng bìng sông H÷ng và 4 tînh khác g÷m

Bíc Giang, Thái Nguyên, Sćn La và Tiền Giang.

Đæu tiên, các méu nçm đāČc kiểm tra PCR bìng

cặp m÷i C.sia-F1/-R1. Tiếp theo các méu nçm

âm tính vĉi cặp m÷i này läi đāČc kiểm tra læn

lāČt bìng các cặp m÷i C.fruc-F/-R1, C.glo-F-R

và C.tru-F/-R theo phāćng pháp loäi trĂ.

3.3. Đánh giá phương pháp chiết nhanh DNA

từ mẫu nấm Colletotrichum bằng NaOH

Bøn cặp m÷i thiết kế đặc hiệu cho 4 loài

Collettotrichum đã đāČc kiểm tra PCR trên các

méu nçm đã đāČc đðnh danh loài. DNA cþa múi

méu nçm đāČc chiết bìng câ 2 phāćng pháp là

CTAB và chiết nhanh bìng NaOH. Kết quâ

kiểm tra PCR (Bâng 3 và Hình 2) cho thçy bëng

PCR đặc hiệu hình thành Ċ 8 méu nçm đều rõ

tāćng đāćng nhau Ċ 2 phāćng pháp.

Kết quâ kiểm tra PCR các méu nçm

Colletotrichum thu thêp (Bâng 4) đã xác đðnh

đāČc 27 méu nçm là loài C. siamense, 11 méu

nçm là loài C. fructicola, 5 méu nçm là loài

C. gloeosporioides sensu stricto và 8 méu nçm là

loài C. truncatum. Riêng méu C29 phân ăng âm

tính vĉi câ 4 cặp m÷i và giâi trình tĆ vùng ApMat

đã xác đðnh méu này là loài C. aeschynomenes

(Nguyễn Duy Hāng và cs., 2017).

Phāćng pháp chiết nhanh bìng NaOH vøn

đāČc áp dĀng đæu tiên để chiết DNA tĂ mô thĆc

vêt (Wang et al., 1993) dĆa trên khâ nëng phån

hþy nhanh vách và màng tế bào thĆc vêt và giâi

phóng DNA cþa NaOH. Gæn đåy, Osmundson et

al. (2013) đã đánh giá phāćng pháp chiết nhanh

DNA cþa nhiều loài nçm thêt và Phytophthora

bìng NaOH cho phân ăng PCR và đã khîng

đðnh phāćng pháp rçt hiệu quâ, tin cêy mặc dù

nëng suçt DNA thu đāČc không cao bìng các

phāćng pháp chiết khác. Trong qui trình cþa

Wang et al. (1993) và Osmundson et al. (2013),

dðch nghiền mô thĆc vêt hoặc nçm trong NaOH

0,5 M đāČc hòa loãng 500 læn vĉi đệm Tris

0,1 M, pH8. Trong nghiên cău cþa chúng tôi,

3.4. Phân bố và mức độ đa dạng của các

loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt

DĆa trên kết quâ PCR, phân bø các loài

nçm Colletotrichum gây bệnh thán thā ĉt täi

đ÷ng bìng sông H÷ng và mût sø tînh đã đāČc

xác đðnh (Bâng 5, Hình 3).

1031

Phát hiện các loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt bằng phản ứng chuỗi polymerase

C. siamense là loài đāČc phát hiện đæu tiên

3.4.1. Phân bố của C. siamense

trên cà phê täi Thái Lan nëm 2009 (Prihastuti

et al., 2009) và có phù ký chþ rçt rûng (Weir et

al., 2012). Mặc dü loài này đã phát hiện gây häi

trên ĉt täi Thái Lan (Suwannarat et al., 2017)

và Ấn Đû (Sharma & Shenoy, 2013), Úc (De

Silva et al., 2017) nhāng läi khöng đāČc liệt kê

trong thành phæn loài häi ĉt täi Trung Quøc

(Diao et al., 2017). Loài C. hymenocallidis, mût

trong các loài phát hiện trên ĉt täi Trung Quøc

(Diao et al., 2017) cÿng chính là C. siamense

theo nghiên cău cþa Liu et al. (2016).

C. siamense là loài nçm phù biến nhçt,

đāČc phát hiện Ċ tçt câ 13 tînh thu thêp méu

g÷m 9 tînh đ÷ng bìng sông H÷ng, 3 tînh trung

du miền núi phía Bíc (Thái Nguyên, Bíc Giang,

Sćn La) và 1 tînh đ÷ng bìng sông CĄu Long

(Tiền Giang) (Bâng 5). Sø lāČng loài này đāČc

phát hiện cÿng nhiều nhçt, chiếm 51,9% tùng sø

méu thu thêp täi 13 tînh (tùng méu = 52) và

51,2% tùng sø méu thu thêp täi đ÷ng bìng sông

H÷ng (tùng méu = 41) (Hình 3).

Bảng 3. PCR so sánh hai phương pháp chiết DNA mẫu nấm

Băng PCR đặc hiệu

ở hai phương pháp chiết DNA nấm

Mẫu

kiểm tra

Cặp mồi

Loài

CTAB

+++

++

NaOH

+++

++

C.glo-F/-R

C. gloeosporioides sensu stricto

C9

C44

C1

C.fruc-F1/-R1

C.sia-F1/-R1

C.tru-F/-R

C. fructicola

C. siamense

C. truncatum

++

C14

C4

++

+++

++

+++

C33

C25

C30

++

+++

Chú thích: ++, +++: mức độ đậm của băng đặc hiệu

Ghi chú: M là thang DNA 100 bp (Generuler 100 bp, Thermo Scientific) với các băng từ 100-500 bp được chỉ

bằng mũi tên. Các giếng là các mẫu nấm đã xác định danh tính: C25 và C30 (C. truncatum), C1 và C14

(C. fructicola), C4 và C33 (C. siamense), C9 và C44 (C. gloeosporioides sensu stricto)

Hình 2. Phản ứng PCR so sánh 2 phương pháp chiết DNA (CTAB và NaOH)

nấm Colletotrichum với 4 cặp mồi đặc hiệu

1032

Nguyễn Duy Hưng, Hà Viết Cường, Hoàng Chúng Lằm

Bảng 4. Phát hiện các loài Colletetotrichum gây bệnh thán thư ớt thu thập bằng PCR

Phản ứng PCR

Năm

thu thập

Mẫu

C1

Địa điểm thu thập

Loài xác định

C. fructicola

C.sia-F1/-R1

C.fruc-F1/-R1

C.glo-F/-R

C.tru-F/R

Trâu Quỳ, Gia Lâm, Hà Nội

2015

-

+

-

+

0

+

-

C2

Trâu Quỳ, Gia Lâm, Hà Nội

0

-

C. siamense

C. fructicola

C3

Quỳnh Hội, Quỳnh Phụ, Thái Bình

Hoàn Long, Yên Mỹ, Hưng Yên

Dạ Trạch, Khoái Châu, Hưng Yên

Đông Tảo, Khoái Châu, Hưng Yên

Tiền Phong, Ân Thi, Hưng Yên

An Bình, Lương Tài, Bắc Ninh

Trung Kênh, Lương Tài, Bắc Ninh

Trấn Dương, Vĩnh Bảo, Hải Phòng

Quỳnh Hải, Quỳnh Phụ, Thái Bình

Nhân Hưng, Lý Nhân, Hà Nam

Dạ Trạch, Khoái Châu, Hưng Yên

Văn Đức, Gia Lâm, Hà Nội

-

C4

+

-

0

-

C. siamense

C. fructicola

C5

0

+

0

+

0

+

0

-

0

+

0

+

0

+

0

+

0

C6

C7

+

-

0

+

-

C. siamense

C. truncatum

C. gloeosporioides s.s

C. fructicola

C8

C9

-

C10

C11

C12

C13

C14

C15

C16

C17

C18

C19

C20

C22

C23

C24

C25

C26

-

+

-

0

+

0

-

C. siamense

C. truncatum

C. fructicola

-

C. gloeosporioides s.s

C. siamense

C. truncatum

C. siamense

C. truncatum

C. gloeosporioides s.s

+

0

+

-

0

Hoàn Long, Yên Mỹ, Hưng Yên

-

+

1033

Phát hiện các loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt bằng phản ứng chuỗi polymerase

C27

C28

C29

C30

C31

C32

C33

C34

C35

C36

C37

C38

C39

C40

C41

C42

C43

C44

C45

C46

C47

C48

C50

C51

C52

C53

C54

Nhân Hưng, Lý Nhân, Hà Nam

Thanh Ninh, Phú Bình, Thái Nguyên

Vân Nội, Đông Anh, Hà Nội

2015

2016

2017

+

-

0

-

0

-

0

-

C. siamense

C. aeschynomenes

C. truncatum

C. siamense

C. fructicola

-

0

-

+

0

+

0

-

Nhân Hưng, Lý Nhân, Hà Nam

Thị trấn Nông trường, Mộc Châu, Sơn La

Đông Sang, Mộc Châu, Sơn La

Long Thành, Long Định, Tiền Giang

Nhân Hưng, Lý Nhân, Hà Nam

Mỹ Tiến, Mỹ Lộc, Nam Định

+

-

0

+

0

+

0

+

-

+

-

0

-

C. siamense

C. fructicola

-

0

-

C. truncatum

C. siamense

C. gloeosporioides s.s

C. siamense

C. fructicola

+

-

0

+

0

-

Mỹ Tân, Mỹ Lộc, Nam Định

Hợp Đức, Tân Yên, Bắc Giang

Song Vân, Tân Yên, Bắc Giang

Cổ Bi, Gia Lâm, Hà Nội

+

-

+

-

C. gloeosporioides s.s

C. fructicola

Cổ Bi, Gia Lâm, Hà Nội

-

+

0

-

0

+

0

+

0

Khánh Vân, Yên Khánh, Ninh Bình

Văn Đức, Gia Lâm, Hà Nội

-

C. fructicola

+

0

+

-

0

-

C. siamense

C. truncatum

C. siamense

C. fructicola

Việt Hồng, Thanh Hà, Hải Dương

Thanh Hải, Thanh Hà, Hải Dương

Kim Tân, Kim Thành, Hải Dương

Hoàng Hanh, Ninh Giang, Hải Dương

+

0

-

0

C. truncatum

C. siamense

+

Chú thích: +: phân ứng PCR dương tính; -: phân ứng PCR âm tính; 0: Không kiểm tra

Mẫu nấm C29 đã được xác định là loài C. aeschynomenes dựa trên giâi trình tự vùng liên gen ApMat (Nguyễn Duy Hưng và cs., 2017)

1034

Nguyễn Duy Hưng, Hà Viết Cường, Hoàng Chúng Lằm

Bảng 5. Phân bố mẫu nấm Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt

thu tại các tỉnh đồng bằng sông Hồng và một số tỉnh khác

Số lượng mẫu nấm theo loài

Số mẫu

Tỉnh

C. gloeosporioides

nấm

C. siamense C. fructicola

C. truncatum C. aeschynomenes

sensu stricto

Bắc Ninh

Hà Nam

Hà Nội

4

5

2

5

1

0

2

1

0

1

8

1

0

2

0

11

1

0

1

0

1

0

5

0

5

0

3

1

0

1

7

0

1

8

0

1

0

1

7

1

Hải Dương

Hải Phòng

Hưng Yên

Nam Định

Ninh Bình

5

3

6

3

6

3

2

1

2

1

Thái Bình

4

2

Đồng bằng sông Hồng

Bắc Giang

Thái Nguyên

Sơn La

41

4

21

3

2

1

3

1

Tiền Giang

Tổng

2

1

52

27

A

B

Hình 3. Phân bố các loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt

từ tất cả các tỉnh (A) và các tỉnh đồng bằng sông Hồng (B)

(Prihastuti et al., 2009) và cÿng cò phù ký chþ

và phân bø đða lý rçt rûng (Weir et al., 2012).

Giøng nhā täi Việt Nam, loài này cÿng phù biến

trên ĉt täi Ấn Đû (Sharma & Shenoy, 2013) và

Trung Quøc (Diao et al., 2017).

3.4.2. Phân bố của C. fructicola

C. fructicola là loài nçm phù biến thă hai,

đāČc phát hiện Ċ 9/13 tînh thu thêp méu g÷m 7

tînh đ÷ng bìng sông H÷ng và 2 tînh trung du

miền núi phía Bíc (Thái Nguyên, Sćn La) (Bâng

5). Sø lāČng loài này đāČc phát hiện nhiều thă

hai, chiếm 21,2% tùng sø méu thu thêp täi 13

tînh và 19,5% tùng sø méu thu thêp täi đ÷ng

bìng sông H÷ng (Hình 3).

3.4.3. Phân bố của C. truncatum

C. truncatum là loài nçm phù biến thă ba,

đāČc phát hiện Ċ 6/13 tînh thu thêp méu g÷m 5

tînh đ÷ng bìng sông H÷ng và Tiền Giang (Bâng

5). Sø lāČng loài này đāČc phát hiện nhiều thă

C. fructicola cÿng là loài đāČc phát hiện đæu

tiên trên cà phê täi Thái Lan nëm 2009

1035

Phát hiện các loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt bằng phản ứng chuỗi polymerase

Hâi Phòng là 3 tînh có thành phæn loài đa däng

ba, chiếm 15,4% tùng sø méu thu thêp täi 13

tînh và 17,1% tùng sø méu thu thêp täi đ÷ng

bìng sông H÷ng (Hình 3).

nhçt khi có sĆ xuçt hiện cþa 4 loài nçm là

C. gloeosporioides, C. siamense, C. fructicola và

C. truncatum täi múi tînh. Hai tînh Hâi Dāćng

và Thái Bình cÿng ghi nhên sĆ xuçt hiện cþa 3

loài nçm là C. siamense, C. fructicola và C.

truncatum. Tînh Bíc Ninh xuçt hiện 3 loài nçm

C. siamense, C. fructicola và C. gloeosporioides.

Các tînh Ninh Bình, Bíc Giang và Sćn La ghi

nhên sĆ xuçt hiện chî 2 loài là C. siamense và

C. fructicola. Duy nhçt, tînh Hà Nam có 100%

sø méu thu thêp là loài C. siamense.

C. truncatum, trāĉc kia đāČc gõi là

C. capsici, là mût trong các loài Colletotrichum

cò Ď nghïa kinh tế vĉi phù ký chþ và tính gây

bệnh rçt đa däng (Ranathunge et al., 2012).

Loài này cÿng là loài phù biến trên ĉt täi Ấn Đû

(Sharma & Shenoy, 2013), Thái Lan (Ko et al.,

2011; Suwannarat et al., 2017), Úc (Da Silva et

al., 2017) và là loài phù biến nhçt trên ĉt täi

Trung Quøc (Diao et al., 2017).

3.4.4. Phân bố của C. gloeosporioides

sensu stricto

5. KẾT LUẬN

Bøn cặp m÷i đāČc thiết kế mĉi đã phát

hiện đặc hiệu 4 loài nçm phù biến gây bệnh

thán thā ĉt là C. truncatum, C. fructicola,

C. gloeosporioides sensu stricto và C. siamense.

C. gloeosporioides sensu stricto là loài phù

biến thă tā, đāČc phát hiện Ċ 5 tînh đ÷ng bìng

sông H÷ng là Hà Nûi, Bíc Ninh, Hâi Phòng,

Hāng Yên và Nam Đðnh (Bâng 5). Sø lāČng loài

này đāČc phát hiện là 5 méu, chiếm 9,6% tùng sø

méu thu thêp täi 13 tînh và 12,2% tùng sø méu

thu thêp täi đ÷ng bìng sông H÷ng (Hình 3).

Phāćng pháp chiết nhanh DNA bìng NaOH

có hiệu quâ cao để chuèn bð méu DNA tĂ nçm

Colletotrichum cho phân ăng PCR.

Bìng phân tích PCR vĉi m÷i đặc hiệu trên

52 méu nçm Colletotrichum gây bệnh thán thā

ĉt thu täi 9 tînh đ÷ng bìng sông H÷ng, 3 tînh

trung du miền núi phía Bíc và 1 tînh đ÷ng bìng

sông CĄu Long xác đðnh đāČc măc đû phù

biến cþa các loài Colletotrichum læn lāČt là

C. siamense (51,9%), C. fructicola (21,2%),

C. truncatum (15,4%), C. gloeosporioides sensu

stricto (9,6%). Chî phát hiện thçy 1 méu là loài

C. aeschynomenes.

C. gloeosporioides sensu stricto ban đæu

đāČc biết có phù ký chþ khá hẹp, nhiễm chþ yếu

trên cây có múi. Tuy nhiên gæn đåy, loài này

cÿng đāČc phát hiện thçy trên xoài, nho, Ficus,

Pueraria, chè (Weir et al., 2012; Udayanga et

al., 2013; Liu et al., 2015). Đáng chý Ď, loài này

đã đāČc xác đðnh phù biến hàng thă hai trên ĉt

täi Trung Quøc (Diao et al., 2017).

3.4.5. Phân bố của C. aeschynomenes

Riêng loài C. aeschynomenes chî phát hiện

TÀI LIỆU THAM KHÂO

Cannon P.F., Damm U., Johnston P.R. & Weir B.S.

(2012). Colletotrichum - current status and future

directions. Studies in Mycology, 73: 181-213.

đāČc

1

méu thu täi Thái Nguyên.

C. aeschynomenes là loài đāČc đðnh danh läi tĂ

C. gloeosporioides “f. sp. aeschynomenes” Loài

này có phù ký chþ và phân bø rçt hẹp, mĉi chî

đāČc công bø gây bệnh trên cåy đêu däi

(Aeschynomene virginica) täi Mỹ (Weir et al.,

2012). Cho tĉi nay vén chāa cò cöng bø thêm về

sĆ xuçt hiện cþa loài này trên thế giĉi.

De Silva D.D., Ades P.K., Crous P.W. & Taylor P.W.J.

(2017). Colletotrichum species associated with

chili anthracnose in Australia. Plant pathology,

66(2): 254-267.

Diao Y.Z., Zhang C., Liu F., Wang W.Z., Liu L., Cai L.

& Liu X.L. (2017). Colletotrichum species causing

anthracnose disease of chili in China. Persoonia:

Molecular Phylogeny and Evolution of Fungi,

38: 20.

3.4.6. Mức độ đa dạng các loài

Colletotrichum tại các tỉnh

Nhìn chung, các tînh đ÷ng bìng sông H÷ng

có măc đû đa däng loài khá cao (Bâng 5). Trong

sø các tînh thu thêp méu, Hà Nûi, Hāng Yên và

Dieffenbach C.W., Lowe T.M., & Dveksler G.S.

(1993). General concepts for PCR primer design.

PCR Methods Appl, 3(3): S30-S37.

1036

Nguyễn Duy Hưng, Hà Viết Cường, Hoàng Chúng Lằm

Don L.D., Van T.T., Phuong Vy T.T. & Kieu P.T.M.

(2007). Colletotrichum spp. Attacking on Chilli

Pepper Growing in Vietnam. Country Report In: Oh

D.G., Kim K.T. (Eds.), Abstracts of the First

International Symposium on Chilli Anthracnose

National Horticultural Research Institute, Rural

Development of Administration, Republic of

Korea, p. 24.

Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt ở đồng bằng

sông Hồng. Tạp chí khoa học công nghệ nông

nghiệp Việt Nam, 12(85): 87-93.

Osmundson T.W., Eyre C.A., Hayden K.M., Dhillon J.

& Garbelotto M.M. (2013). Back to basics: an

evaluation of NaOH and alternative rapid DNA

extraction protocols for DNA barcoding,

genotyping, and disease diagnostics from fungal

and oomycete samples. Molecular ecology

resources, 13(1): 66-74.

Doyle J.J. & Doyle J.L. (1987). A rapid DNA isolation

procedure for small quantities of fresh leaf tissue.

Phytochemical Bulletin, 19: 11-15.

Peres N., Souza N., Peever T. & Timmer L. (2004).

Benomyl sensitivity of isolates of Colletotrichum

acutatum and C. gloeosporioides from citrus. Plant

Disease, 88: 125-130.

Hyde K., Cai L., McKenzie E., Yang Y., Zhang J. &

Prihastuti H. (2009). Colletotrichum: a catalogue

of confusion. Fungal Diversity, 39: 1-12.

Imjit N., Rattanakreetakul C. & Pongpisutta R. (2012).

Polymerase chain reaction based detection of Chilli

anthracnose disease. In I International Conference

on Postharvest Pest and Disease Management in

Exporting Horticultural Crops-PPDM2012 973,

pp. 199-206

Prihastuti H., Cai L., Chen H., McKenzie E.H.C. &

Hyde

K.D.

(2009).

Characterization

of

Colletotrichum species associated with coffee

berries in northern Thailand. Fungal Diversity,

39(1): 89-109.

Ranathunge N.P., Mongkolporn O., Ford R. & Taylor

Judelson H. (2006). Guidelines For Designing Primers.

Primer Guidelines, 10(6): 1-5.

P.W.J.

Pathosystem on Capsicum spp: infection,

colonization and defence mechanisms.

(2012).

Colletotrichum

truncatum

Kamle M., Pandey B.K., Kumar P. & Kumar M.

(2013). A Species-Specific PCR based Assay for

rapid detection of mango anthracnose pathogen

Colletotrichum gloeosporioides Penz and Sacc. J.

Plant Pathol. Microbiol., 4(184): 10-4172.

Australasian Plant Pathology, 41(5): 463-473.

Rychlik W. (1993). Selection of primers for

polymerase chain reaction. In PCR Protocols.

Humana Press, Totowa, NJ., pp. 31-40.

Ko T.W.K., McKenzie E.H.C., Bahkali A.H., To-anun

C., Chukeatirote E., Promputtha I., Ahmed K.,

Wikee S., Chamyuang S. & Hyde K.D. (2011).

The need for re-inventory of Thai phytopathogens.

Chiang Mai Journal of Science, 38: 625-637.

Rychlik W.J.S.W., Spencer W.J. & Rhoads R.E.

(1990). Optimization of the annealing temperature

for DNA amplification in vitro. Nucleic acids

research, 18(21): 6409-6412.

Sharma G. & Shenoy B.D. (2013). Colletotrichum

fructicola and C. siamense are involved in chilli

anthracnose in India. Archives Of Phytopathology

And Plant Protection, 47: 1179-1194.

Larkin M.A., Blackshields G., Brown N.P., Chenna R.,

McGettigan P.A., McWilliam H. & Thompson J.D.

(2007). Clustal W and Clustal X version 2.0.

bioinformatics, 23(21): 2947-2948.

Shi A., Kantartzi S.K., Mmbaga M.T., Chen P., Mrema F.

& Nnodu E. (2008). PCR-based markers for detection

of Colletotrichum acutatum and C. gloeosporioides in

flowering dogwood (Cornus florida). Australasian

Plant Pathology, 37(1): 65-68.

Liu F., Wang M., Damm U., Crous P.W., & Cai L.

(2016). Species boundaries in plant pathogenic

fungi:

a

Colletotrichum case study. BMC

evolutionary biology, 16(1): 81.

Liu F., Weir B.S., Damm U., Crous P.W., Wang Y.,

Silva D.N., Talhinhas P., Várzea V., Cai L., Paulo O.S.

Liu B.

&

Cai L. (2015). Unravelling

&

Batista D. (2012). Application of the

Colletotrichum species associated with Camellia:

employing ApMat and GS loci to resolve species

in the C. gloeosporioides complex. Persoonia:

Molecular Phylogeny and Evolution of Fungi,

35: 63.

Apn2/MAT locus to improve the systematics of the

Colletotrichum gloeosporioides complex: an

example

hosts. Mycologia, 104(2): 396-409.

Srinivasan M., Kothandaraman S.V., Vaikuntavasan P.

Rethinasamy V. (2014). Development of

from

coffee

(Coffea

spp.)

Mongkolporn O., Montri P., Supakaew T. & Taylor P.

W. (2010). Differential Reactions on Mature Green

and Ripe Chili Fruit Infected by Three

Colletotrichum spp. Plant Disease, 94: 306-310.

&

conventional and real-time PCR protocols for

specific and sensitive detection of Colletotrichum

capsici in chilli (Capsicum annuum L.).

Phytoparasitica, 42(4): 437-444.

Ngô Bích Hảo (1992). Bệnh thán thư hại ớt, Tạp chí

Bảo vệ thực vật, 124(4): 15-17.

Suwannarat S., Steinkellner S., Songkumarn P. &

Sangchote S. (2017). Diversity of Colletotrichum

spp. isolated from chili pepper fruit exhibiting

Nguyễn Duy Hưng, Hà Viết Cường, Hoàng Chúng

Lằm, Nguyễn Đức Huy (2017). Xác định nấm

1037

Phát hiện các loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt bằng phản ứng chuỗi polymerase

symptoms of anthracnose in Thailand. Mycological

Progress, 16(7): 677-686.

E. & Hyde K.D. (2013). What are the common

anthracnose pathogens of tropical fruits? Fungal

Diversity, 61(1): 165-179.

Than P.P., Prihastuti H., Phoulivong S., Taylor P.W. &

Hyde K.D. (2008). Chilli anthracnose disease

caused by Colletotrichum species. Journal of

Zhejiang University Science B, 9: 764-778.

Wang H., Qi M. & Cutler A.J. (1993). A simple

method of preparing plant samples for PCR.

Nucleic acids research, 21(17): 4153.

Weir B.S., Johnston P.R. & Damm U. (2012). The

Colletotrichum gloeosporioides species complex.

Studies in Mycology 73: 115-180

Torres-Calzada C., Tapia-Tussell R., Quijano-Ramayo

A., Martin-Mex R., Rojas-Herrera R., Higuera-

Ciapara I. & Perez-Brito D. (2011). A species-

specific polymerase chain reaction assay for rapid

and sensitive detection of Colletotrichum capsici.

Molecular biotechnology, 49(1): 48-55.

Yao J., Lan C., Huang P. & Yu D. (2018). PCR

detection of Colletotrichum gloeosporioides in

Psidium guajava. Australasian Plant Pathology,

47(1): 95-100.

Udayanga D., Manamgoda D.S., Liu X., Chukeatirote

1038