Tạo chủng Vibrio harveyi đột biến gen WZZ có khả năng biểu hiện Protein vỏ VP28 của vi rút gây bệnh đốm trắng WSSV (White spot syndrome virus) trên tôm
Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 7(92)/2018
Plumb, J. A., Vinitnantharat, S., Paterson, W. D.,
Salonius, K., A.F.S.F.H.S, 1995. Prevention of
enteric septicemia in catfish by vaccination. Diseases
in Asia Aquaculture, 2: 399 - 404.
Reed, L.J., & H. Muench, 1938. A simple method
of estimaing fify percent endpoints. Journal of
Epidemiology, 27 (3): 493 - 497.
une, R.L., Fernandez, D.H., & Battista, J.R, 1999.
An aroA Mutant of Edwardsiella ictaluri Is Safe and
Efficacious as a Live, Attenuated Vaccine. Journal of
Aquatic Animal Health 11(4):358–372.
Waltman, W.D., Shotts, E.B., & Hsu, T.C., 1986.
Biochemical characteristics of Edwardsiella ictaluri.
Applied and environmental microbiology, 51(1): 101 - 4.
Yuasa, K., Kholidin, E.B., Panigoro, N., & Hatai, K,
2003. First Isolation of Edwardsiella ictaluri from
Cultured Striped Catfish Pangasius hypophthalmus
in Indonesia. Fish Pathology, 38 (4): 181-183.
Shoemaker C, Klesius P, Bricker J, 1999. Efficacy
of a modified live Edwardsiella ictaluri vaccine in
channel catfish as young as seven days post hatch.
Aquaculture 176(3):189 - 193.
Edwardsiella ictaluri wzz mutant as a potential vaccine for preventing
bacillary necrosis on catfish (Pangasionodon hypophthalmus)
Bui i anh Tinh, Tran Hanh Triet, Tran Van Huong,
Vu i anh Huong, Duong Hoa Xo, Nguyen Quoc Binh
Abstract
Bacillary necrosis on catfish (P. phthalmus) infected by Edwardsiella ictaluri causes major economic losses because
of high mortality rates (60 - 80 %) and occur at high frequency. Vaccination is an urgent issue as use of antibiotic
leads to drug resistance and hinders export. However, the type of the vaccine as well as the mode of vaccination,
stage of fish development to vaccinate is the problems to resolve. Biotechnology Center of Ho Chi Minh conducted
studies on live attenuated Edwardsiella ictaluri strains against bacillary necrosis and found the Edwardsiella ictaluri
wzz mutant (O-antigen chain length determinant gene) was created by knockout gene method which gave the best
results. Laboratory-scale experiments showed that this strain was safe and had efficacious in Tra catfish by one time
immersion at fried stage and 2.5-month-old Tra catfish with relative percent survival were 30% and 65%, respectively,
while it was 95% for the twice immersion fish at fried stage and 2.5-month-old Tra catfish. is is an attenuated
Edwardsiella ictaluri strains have potentials used as immersion vaccine for Tra catfish.
Keywords: Edwardsiella ictaluri, modified live Edwardsiella ictaluri vaccine, Tra catfish (Pangasionodon hypophthalmus),
Bacillary necrosis
Ngày nhận bài: 2/6/2018
Ngày phản biện: 20/6/2018
Người phản biện: PGS.TS. Phạm Minh Đức
Ngày duyệt đăng: 16/7/2018
TẠO CHỦNG VIBRIO HARVEYI ĐỘT BIẾN GEN WZZ CÓ KHẢ NĂNG
BIỂU HIỆN PROTEIN VỎ VP28 CỦA VI RÚT GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG WSSV
(WHITE SPOT SYNDROME VIRUS) TRÊN TÔM
Mai u ảo1, Trần Phạm Vũ Linh1, Ngô Huỳnh Phương ảo1,
Lâm Vỹ Nguyên1, Nguyễn Quốc Bình1
TÓM TẮT
Trên thế giới đã có nhiều cách tiếp cận để phát triển các chế phẩm ngăn ngừa bệnh đốm trắng ở tôm. Trong
nghiên cứu này, nhóm tác giả tiếp cận bằng cách gây đột biến gen trên chủng Vibrio harveyi gây bệnh phát sáng trên
tôm và biểu hiện protein vỏ VP28 của vi rút gây bệnh đốm trắng trên chủng này. Cassette HKTwzz (ΔHKTwzz) gồm
trình tự Hwzz (phần đầu gen wzz); K (trình tự gen kháng Kanamycin), Twzz (phần cuối gen wzz) được tạo ra bằng
PCR overlap. Sau đó, trình tự Ptac-VP28 được chèn vào ΔHKTwzz nhờ vào vị trí enzyme NdeI nằm trên cassette.
ΔHKTwzz có gắn Ptac-VP28 được chèn vào pGP704 và tạo dòng trong E. coli SM10λpir. Chủng đột biến được tạo
ra bằng phương pháp tiếp hợp giữa chủng cho là E. coli SM10λpir::pGP704::ΔHKTwzz::Ptac-VP28 và chủng nhận
Vibrio harveyi hoang dại BL1 (được thu nhận từ ao tôm bệnh ở Bạc Liêu) dựa trên cơ chế tái tổ hợp tương đồng trên
vùng trình tự Hwzz và Twzz. Các kết quả kiểm tra biểu hiện bằng phương pháp SDS-PAGE và Western Blot cho thấy
chủng đột biến có khả năng biểu hiện protein vỏ VP28.
Từ khóa: Knock-out gen, pGP704, SM10λpir, tiếp hợp, tái tổ hợp tương đồng
1 Trung tâm Công nghệ Sinh học TP. Hồ Chí Minh
117
Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 7(92)/2018
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
phương pháp loại bỏ một phần gen wzz và biểu hiện
protein vỏ VP28 trong chủng này với mục tiêu sử
dụng chủng này như một vật mang protein vỏ VP28
vào trong cơ thể tôm.
Bệnh đốm trắng luôn là dịch bệnh nguy hiểm
nhất đối với ngành nuôi tôm. Một khi đã mắc bệnh,
tôm có thể chết cả ao trong vòng 3 - 10 ngày. Nghiên
cứu vắc xin cho tôm đang đặt ra thách thức đối với
các nhà khoa học. Đối với tôm không thể gây đáp
ứng miễn dịch 1 lần và đòi hỏi bộ nhớ miễn dịch duy
trì lâu dài để bảo vệ tôm khỏi các kháng nguyên xâm
nhập (Rowley and Powell, 2007). VP28 là protein cấu
trúc của WSSV và cũng là protein quan trọng nhất
cho cơ chế xâm nhiễm vào tế bào của WSSV. Protein
dung hợp VP28-EGFP có khả năng bám vào tế bào
tôm ở pH=6 trong vòng 0,5 h. Nhóm nghiên cứu
đã tìm thấy VP28-EGFP có mặt trong tế bào chất.
Điều này có thể giải thích VP28 đã xâm nhập vào tế
bào tôm bằng cơ chế nhập bào (endocytosis) với cấu
trúc protein bám vào tế bào tôm tương tự như trên
màng tế bào WSSV (Qi Y et al., 2004). Ở vi khuẩn,
chiều dài chuỗi O-antigen được điều hòa bởi gen
wzz, còn được gọi là Cld [chain length determinant]
hay Rol [regulator of O-antigen length]. Khi chủng
vi khuẩn bị đột biến gen wzz thì chiều dài chuỗi
O-antigen sẽ phân bố một cách ngẫu nhiên (Franco
et al., 1998; Najdenski et al., 2003). Từ đó, chủng đột
biến sẽ bị giảm tính độc hoặc mất đi tính độc do
chuỗi O-antigen gây ra. Nghiên cứu này đã sử dụng
Vibrio harveyi, là một vi khuẩn gây bệnh phát sáng
trên tôm (Liu et al., 1996) được gây đột biến bằng
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
Chủng hoang dại Vibrio harveyi BL1 được phân
lập từ ao nuôi tôm tại tỉnh Bạc Liêu; các chủng E.
coli SM10 λpir, E. coli BL21 được cung cấp bởi Trung
tâm Công nghệ Sinh học TP. HCM; các véc tơ tạo
dòng: pJET 1.2/blunt, pKD4, pGP704; môi trường
TCBS (iosulfate - Citrate Bile - Sucrose), VHA
(Vibrio harveyi agar) để phân lập V. harveyi; hóa chất
sinh học phân tử: primer, master mix PCR, enzyme
cắt giới hạn NedI, enzyme bất hoạt đầu 3’-P.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phân lập và định danh vi khuẩn
Đĩa TCBS phân lập Vibrio spp. được thu nhận tại
Chi cục nuôi trồng ủy Sản tỉnh Bạc Liêu. Khi đem
về Trung tâm Công nghệ Sinh học TP. Hồ Chí Minh,
tiến hành phân lập trên môi trường VHA (Harris et
al., 1996), môi trường dùng để định danh V. har veyi
và tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi F-luxN,
R-luxN (Hernandez and Olmos, 2004) đặc hiệu cho
V. har veyi khuếch đại vùng trình tự dài 2048 bp trên
gen luxN của V. har veyi (Bảng 1).
Bảng 1. Danh sách các cặp mồi sử dụng trong quá trình tạo cassette HKTwzz
STT
Tên mồi
F-luxN
R-luxN
KF
KR
WF1
Gen
Trình tự
5’- CTGTGTACTCACTGTTTATC-3’
5’- GTCTAATTCGCGTTCTCCA -3’
5’- GTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’
5’- GACATGGGAATTAGCCATGGTCC -3’
5’- ACGGTCAGATGCCAATAGCTCCTG-3’
5’-GAAGCAGCTCCAGCCTACACAGACGAAAAGCT-
GTTCAGCGAAGC -3’
5’- GGACCATGGCTAATTCCCATGTCGGGACTTGATTC-
GTAGGGGC-3’
1
luxN
2
3
Kanamycin
Hwzz
WR1
WF2
4
5
Twzz
WR2
Fi-K
5’- GTGGCAATCAATAGCTTCCGCCT-3’
5’- CTGGACGAAGAGCATCAGGG -3’
Vùng trình tự 435
bp bên trong gen
kanamycin
Vùng trình tự
2384 bp bên ngoài
gen wzz
Ri-K
5’- CGGAAAACGATTCCGAAGCC -3’
5’-TTACCGAAAGCAGAGGTGGG-3’
5’-TCCTGATCACTTCAGACGGC-3’
Fo-wzz
Ro-wzz
6
7
VP28-F
VP28-R
5’-ATGGATCTTTCTTTCACTCTTTCGG-3
5’-TTACTCGGTCTCAGTGCCAGAG-3’
VP28
118
Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 7(92)/2018
2.2.2. Tạo chủng E.coli SM10λpir mang plasmid
pGP704 có chèn cassette HKTwzz gắn vùng trình tự
Ptac-VP28 (ΔHKTwzz::Ptac-VP28)
Đoạn đầu Hwzz và đoạn cuối Twzz được khuếch
đại từ bộ gen chủng V. har veyi với các cặp mồi
WF1+WR1 và WF2+WR2; gen Kanamycin (K)
được khuếch đại từ plasmid pKD4 bằng cặp mồi
KF+KR (Bảng 1).
Ba đoạn gen được tiến hành PCR overlap để tạo
trình tự HKTwzz. Cassette HKTwzz được chèn vào
trong véc tơ pGP704 (trường Đại học Harvard) và
tạo dòng trong E.coli DH5αλpir (Biomedal). Trình
tự Ptac-VP28 được gắn vào vector pAmCyanN1-1
đã được kiểm tra biểu hiện tốt trong E.coli BL21. Tiến
hành cắt mở vòng pGP704::HKTwzz tại vị trí NdeI để
gắn trình tự Ptac-VP28 vào véc tơ tái tổ hợp tại vị trí
này. Véc tơ tái tổ hợp pGP704::HKTwzz::Ptac-VP28
được tạo dòng trong E.coli SM10λpir (Biomedal).
ΔHKTwzz::Ptac-VP28 được sử dụng để gây đột biến
gen wzz và có gen kháng kanamycin là chỉ thị để
chọn lọc dòng đột biến (Hình 1).
oriR6K nhân lên; đồng thời pGP704 cũng mang yếu
tố di động mob nên có thể sát nhập vào nhiễm sắc
thể SM10 λpir và di chuyển vào trong chủng nhận là
Vibrio harveyi (une et al., 2011).
Trộn 2 chủng E. coli SM10λpir và V. har veyi theo
tỷ lệ 1 : 1 và ủ qua đêm ở 28oC để diễn ra quá trình
tái tổ hợp tương đồng. Sau quá trình tiếp hợp véc
tơ pGP704 mang cassette đi vào trong bộ gen chủng
nhận nhưng không thể nhân lên vì thiếu gen pir,
ΔHKTwzz::Ptac-VP28 có thể sát nhập vào bộ gen
nhiễm sắc thể bằng tái tổ hợp tương đồng nhờ sự
trao đổi chéo giữa 2 vùng trình tự tương đồng trên
véc tơ và gen tương ứng trên nhiễm sắc thể. Quá
trình chọn lọc chủng đột biến trên môi trường LB
có chứa kháng sinh kanamycin và colistin. Vì véc tơ
pGP704 không tự nhân lên được trong chủng nhận
V. har veyi nên các khuẩn lạc V. har veyi mọc trên
môi trường có chứa kháng sinh được nghi ngờ là
các dòng vi khuẩn đột biến gen (Hình 2). Chủng đột
biến được ký hiệu VH-WzM::Ptac-VP28.
Hình 2. Sơ đồ trao đổi chéo giữa 2 vùng trình tự tương
đồng trong quá trình tiếp hợp giữa E. coli và V. har veyi
Hình 1. Sơ đồ vị trí cắt NdeI trên Δ HKTwzz
để chèn Ptac-VP28
2.2.4. Ki2.4. -WzM::Ptac-VP28.
2.2.3. Tiếp hợp
Vùng trình tự bị loại bỏ của gen wzz dài 1521
bp thay vào đó là trình tự gen kháng Kanamycin và
Ptac-VP28 dài 2200 bp. Tiến hành kiểm tra trước và
sau đột biến bằng PCR với các cặp mồi sau theo như
sơ đồ (Hình 3).
SM10λpir chứa cassette được sử dụng làm chủng
cho vì nó có yếu tố chuyển RP4 nằm trên nhiễm sắc
thể và chứa gen pir mã hóa cho protein π cho phép
các véc tơ pGP704 mang điểm khởi đầu sao chép
Hình 3. Sơ đồ các cặp mồi kiểm tra chủng đột biến
119
Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 7(92)/2018
- Fo-wzz + Ri-K và Ro-wzz + Fi-K: trình tự mồi
Fo-wzz nằm trên genome của V. har veyi, nằm ngoài
mồi WF1, trình tự mồi Ro-wzz nằm trên genome
của V. har veyi, nằm ngoài mồi WR2. Chạy kết hợp
2 cặp mồi này cho phép xác định cassette có được
chèn thẳng trực tiếp vào trong bộ gen của V. har veyi
hay không.
- Fi-wzz + Ri-wzz: khuếch đại vùng trình tự nằm
bên trong gen wzz từ vị trí 460070 đến vị trí 460365.
Vùng này sẽ bị loại bỏ trong quá trình gây đột biến.
2.3. ời gian và địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành tại phòng thí nghiệm
Công nghệ sinh học ủy sản, Trung tâm Công nghệ
Sinh học từ tháng 4/2012 đến tháng 12/2015.
III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả nghiên cứu
3.1.1. Phân lập và định danh vi khuẩn
Đĩa Vibrio phân lập trên môi trường TCBS từ
Chi cục nuôi trồng ủy Sản tỉnh Bạc Liêu sau khi
mang về được cấy truyền lại trên môi trường VHA
để quan sát hình thái khuẩn lạc trên môi trường này.
Qua quan sát thấy rằng chủng phát sáng sau khoảng
18 giờ cấy (Hình 4). Đồng thời, khuẩn lạc trên môi
trường VHA có hình tròn, nhỏ, đường kính khoảng
1-2 mm, có màu xanh lá cây sáng bóng ở bên ngoài
và màu xanh đậm tối ở giữa. Một số khuẩn lạc có
vòng sáng viền bên ngoài giống với mô tả về hình
thái khuẩn lạc V. har veyi lạc trên môi trường VHA
trong nghiên cứu của Lachlan Harris và cộng tác
viên (1996).
DNA bộ gen được sử dụng làm bản mẫu để
khuếch đại vùng trình tự 2048 bp từ vị trí 1759
đến vị trí 3806 của operon LuxN (gb/L13940.1/
VIBLUXLMN) với cặp mồi F-luxN + R-luxN. Kết
quả chạy điện di sản phẩm PCR có băng đặc trưng
2048 bp đặc hiệu của V. har veyi (Hình 5).
- KF + KR: phát hiện vùng trình tự gen kháng
kanamycin trong chủng đột biến, có kích thước là
1498 bp.
2.2.5. Biểu hiện protein vỏ VP28 trong chủng đột biến
Chủng đột biến được lên men ở 280C cho đến khi
đạt được OD=1. u nhận sinh khối và huyền phù
cặn trong dung dịch đệm (100 mM NaCl, 25 mM Tris
HCl, pH=8). Tiến hành phá màng tế bào bằng sóng
siêu âm. Ly tâm để loại bỏ xác tế bào và thu nhận
dịch protein tổng số. Sau đó, tiến hành tủa protein
tổng bằng TCA 20%, ủ đá lạnh trong 10 phút, rửa
cặn 3 lần với acetone lạnh. Sau đó, tiến hành hòa
tan cặn trong nước. Tiến hành phân tích SDS-PAGE
và WESTERN BLOT bằng kháng thể thỏ đa dòng
đặc hiệu kháng VP28 được cung cấp bởi Trung tâm
Công nghệ Sinh học.
1
2
3
4
Hình 4. Đĩa khuẩn lạc V. har veyi
Hình 5. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi
khuếch đại gen luxN. (1): chứng âm nước; (2),
(3): khuẩn lạc V. harveyi; (4): thang DNA
phát sáng sau 18 giờ
3.1.2. Tạo chủng E.coli SM10λpir mang plasmid
pGP704 có chèn cassette HKTwzz gắn vùng trình tự
Ptac-VP28 (ΔHKTwzz::Ptac-VP28)
Ở lần PCR thứ 1, khuếch đại trình tự các đoạn
H-wzz (346 bp), T-wzz (303 bp) và gen kháng
Kanamycin (1498 bp). Kết quả điện di trên gel
agarose cho ra kết quả đúng với lý thuyết (Hình 6).
Ở lần PCR thứ 2 khi trộn các đoạn H-wzz, R-wzz,
Kan theo tỉ lệ 0,1 pmol mỗi đoạn với mồi WF1 và
WR2 cho sản phẩm có nhiều băng trên bản gel điện
di. Tinh sạch băng cho kết quả đúng kích thước của
ΔHKTwzz trên gel bằng kit Introns (Hàn Quốc) cho
ra đúng một băng có kích thuớc khoảng hơn 2000
bp (Hình 7).
Véc tơ pGP704::HKTwzz được cắt mở vòng
với NdeI sẽ cho sản phẩm có 1 băng có kích thước
khoảng 5845 bp vì pGP704 có kích thước là 3703 bp
và ΔHKTwzz có kích thước là 2142 bp. Sản phẩm
120
Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 7(92)/2018
cắt cho ra kết quả khoảng gần 6000 bp (Hình 8) và
được bất hoạt 2 đầu 5’-P bằng enzyme Antarctic
Phosphatase. Sản phẩm cắt sau khi bất hoạt đầu 5’-P
được tinh sạch bằng cồn để thu nhận phân đoạn
pGP704::HKTwzz ở dạng thẳng có 2 đầu là vị trí cắt
của NdeI.
Plamid tái tổ hợp pJET::Ptac-VP28 được cắt với
NdeI cho ra sản phẩm có 2 băng. Một băng là phân
đoạn của Ptac-VP28 có kích thước là ~ 700 bp có 2
đầu là vị trí cắt so le của NdeI. Một băng là phân đoạn
còn lại của pJET có kích thước là 2974 bp (Hình 9).
1
2
3
4
5
ΔHKTwzz M
Hình 6. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi
khuếch đại gen Hwzz (1), Twzz (2), kanamycin (3),
chứng âm là nước (4), thang DNA (5)
Hình 7. Kết quả điện di sản phẩm
tinh sạch ΔHKTwzz
Sản phẩm nối được tạo dòng trong E. coli
SM10λpir và chọn lọc trên môi trường LB +
ampicilin (100 µg/ml) + kanamycin (100 µg/ml). Vì
trong ΔHKTwzz có chứa gen kháng kanamycin nên
các khuẩn lạc được tạo dòng thành công sẽ mọc trên
môi trường chọn lọc này.
Kết quả kiểm tra khuẩn lạc với cặp mồi KF và KR,
cặp mồi khuếch đại gen kháng kanamycin và nằm 2
bên vị trí cắt NdeI: khi không có gen VP28 chèn vào
tại vị trí NdeI thì sản phẩm khuếch đại từ cặp mồi KF
và KR cho kích thước là 1498 bp; nếu có Ptac-VP28
chèn vào thì sản phẩm khuếch đại cho kích thước là
2196 bp (Hình 10).
1
2
1
2
1
2
3
4
Hình 8. Kết quả điện di sản phẩm
cắt pGP704::HKTwzz.
(1): sản phẩm cắt pGP704::HKTwzz
với NdeI; (2) thang DNA
Hình 9. Sản phẩm cắt
pJET::Ptac-VP28.
(1): thang DNA; (2): sản phẩm
cắt pJET::TAC-VP28 với NdeI
Hình 10. Kết quả điện di sản phẩm
PCR khuẩn lạc với cặp mồi KF và KR.
(1) Khuẩn lạc E. coli SM10λpir::pG-
P704::ΔHKTwzz::Ptac-VP28; (2) chứng
âm là nước; (3): SM10λpir::pGP704::
HKTwzz; (4): thang DNA
3.1.3. Tiếp hợp và kiểm tra chủng đột biến
trên gen hoang dại. Khi kiểm tra khuẩn lạc tiếp hợp
với mồi KF+KR phát hiện vùng trình tự gồm gen
kháng kanamycin gắn với trình tự Ptac::VP28 có
kích thước khoảng 2200 bp so với đối chứng dương
là SM10λpir::pGP704::Ptac-VP28 (Hình 11).
Quá trình tạo đột biến gen hoang dại đã được
thay thế bằng gen kháng kanamycin gắn với vùng
trình tự Ptac + VP28 nhờ cơ chế tái tổ hợp tương
đồng ở vị trí H và T của cassette với vị trí H và T
121
Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 7(92)/2018
1
2
3
4
Khi kiểm tra với mồi Fi-wzz + Ri-wzz để khuếch
đại vùng trình tự nằm bên trong gen wzz từ vị trí
460070 đến vị trí 460365. Vùng này sẽ bị loại bỏ
trong quá trình gây đột biến. Kết quả kiểm tra các
khuẩn lạc đột biến sau khi cấy truyền đều không có
sự tồn tại của vùng này (Hình 12) so với đối chứng
dương là chủng V. har veyi hoang dại cho băng có
kích thước khoảng 300 bp. Khi kiểm tra với cặp mồi
Fo-wzz + Ri-K với mồi Fo-wzz nằm trên genome
của V. har veyi, nằm ngoài mồi WF1 cho kích thước
khoảng 1700 bp; tương tự kiểm tra với cặp mồi
Ro-wzz + Fi-K với trình tự mồi Ro-wzz nằm trên
genome của V. har veyi, nằm ngoài mồi WR2 cho
kích thước khoảng 2000 bp. Cả hai cặp mồi cho phép
xác định cassette có được chèn thẳng trực tiếp vào
trong bộ gen của V. har veyi hay không (Hình 13).
Hình 11. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR
khuẩn lạc trên đĩa tiếp hợp với cặp mồi KF và KR.
1: khuẩn lạc tiếp hợp; 2: SM10λpir::pGP704:: HKTwzz;
3: SM10λpir::pGP704:: ΔHKTwzz::Ptac-VP28;
4: thang DNA
1
2
3
4
5
6
7
8
M
1
2
3
4
5
6
Hình 12. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR
các khuẩn lạc đột biến với cặp mồi Fi-wzz + Ri-wzz.
(1): thang DNA; (2-6): các khuẩn lạc cấy truyền từ
khuẩn lạc đột biến trên đĩa tiếp hợp; (7): khuẩn lạc
V. harveyi hoang dại BL1; (8): chứng âm là nước
Hình 13. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR
các khuẩn lạc đột biến với cặp mồi kết hợp Fo-wzz
+ Ri-K và Ro-wzz + Fi-K. (1, 4): khuẩn lạc đột biến;
(2, 5): khuẩn lạc V. har veyi hoang dại BL1; (3, 6):
SM10λpir::pGP704:: ΔHKTwzz::Ptac-VP28
3.1.4. Biểu hiện protein vỏ VP28 trong chủng đột biến
E. coli BL21::pAmCyan1-N1::Ptac-VP28 biểu hiện
mạnh protein vỏ VP28 ở băng 28 KDa (Hình 14).
Khi phân tích Western Blot thấy rằng chủng đột
biến VH-WzM::Ptac-VP28 có khả năng biểu hiện
protein vỏ VP28 so với đối chứng dương là E.coli
BL21::pAmCyan1-N1::Ptac-VP28 (Hình 15).
Kháng thể đa dòng chuột kháng VP28 có khả
năng bắt đặc hiệu kháng nguyên VP28 trên màng lai.
Đồng thời, kháng thể sơ cấp này sẽ bị bắt đặc hiệu
bởi kháng thể sơ cấp (kháng thể thỏ kháng kháng
thể chuột) và hiện màu khi tiếp xúc với chất tạo màu
DAB (3,3’-diaminobenzidine). Kết quả kiểm tra biểu
hiện cho thấy có sự biểu hiện protein vỏ VP28 trong
chủng V. har veyi đột biến gen wzz mang gen mã hóa
protein vỏ VP28 của vi rút gây bệnh đốm trắng.
Ở kết quả phân tích SDS-PAGE không cho
thấy sự khác biệt rõ ràng trong hệ protein tổng
giữa chủng V. har veyi đột biến gen wzz mang gen
mã hóa protein vỏ VP28 của vi rút gây bệnh đốm
trắng (VH-WzM::Ptac-VP28) và chủng V. har veyi
đột biến gen wzz không chứa gen mã hóa protein
vỏ VP28 (VH-WzM) cũng như chủng V. har veyi
hoang dại BL1 so với đối chứng dương là chủng
3.2. ảo luận
Nghiên cứu này đã tạo được chủng V. har veyi
đột biến gen wzz biểu hiện protein vỏ VP28 của vi
rút gây bệnh đốm trắng bằng phương pháp gây đột
biến gen dựa vào cơ chế trao đổi chéo giữa 2 vùng
trình tự tương đồng ở vi khuẩn. Hiện nay, trên thế
giới vẫn chưa có công bố nào về việc gây đột biến
bằng phương pháp loại bỏ một phần gen wzz trên
V. har veyi hướng đến như là vắc xin phòng bệnh cho
tôm. Năm 2011, chủng V. har veyi bất hoạt đã được
chứng minh là có khả năng làm gia tăng đáp ứng
miễn dịch ở tôm (Rowley et al., 2011). Năm 2012, một
122
Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 7(92)/2018
hướng nghiên cứu về việc gây đột biến ngẫu nhiên
chủng V. har veyi T4D bằng kháng sinh rifampicin
để tạo vắc xin cho cá bơn (Sun et al., 2012). Điều
này chứng tỏ V. har veyi bất hoạt hoặc nhược độc có
khả năng sinh miễn dịch. Tạo vi khuẩn nhược độc
bằng knock-out gen là một hướng nghiên cứu rất
mới hướng đến việc tạo vắc xin vi khuẩn sống nhược
độc để tiếp cận bằng con đường ngâm hoặc cho ăn
đối với tôm. Nghiên cứu sử dụng promoter TAC
(Ptac) trong chủng V. cholerae để biểu hiện độc tố B
của E. coli (CtxB) bằng véc tơ pETR1, Ptac đã được
chứng minh là phù hợp nhất khi biểu hiện trong
chủng V. cholerae (John M et al., 1999). Do không
thể tiến hành các phương pháp biến nạp véc tơ tái
tổ hợp biểu hiện VP28 vào V. har veyi nên nhóm
nghiên cứu đã chèn trực tiếp Ptac-VP28 vào bộ gen
của vi khuẩn V. harveyi. Chủng VH-WzM::Ptac-
VP28 có khả năng biểu hiện protein vỏ VP28 nhưng
hiệu quả không cao so với đối chứng dương E.coli
BL21:: pAmCyan1-N1::Ptac-VP28. Có thể giải thích
nguyên nhân là do việc chèn trực tiếp gen mã hóa
cho protein vỏ VP28 vào bộ gen V. har veyi làm giảm
đi rất nhiều số lượng bản sao của gen này so với việc
sử dụng véc tơ tái tổ hợp để biểu hiện. Tuy nhiên,
hiệu quả bảo vệ chủng V. har veyi đột biến này cần
phải được thử nghiệm trên tôm ở giai đoạn tiếp theo.
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
Hình14. KếtquảphântíchSDS-PAGEkiểmtrabiểuhiện
protein vỏ VP28. (1): thang protein; (2): chủng đột biến
VH-WzM::Ptac-VP28; (3): chủng BL21::pAmCyan1-
N1::Ptac-VP28; (4): chủng đột biến gen wzz không chứa
Ptac-VP28; (5): chủng V. har veyi hoang dại BL
Hình 15. Kết quả phân tích Western Blot kiểm tra biểu
hiện protein vỏ VP28. (1): chủng đột biến VH-WzM::P-
tac-VP28; (2): chủng BL21:: pAmCyan1-N1::Ptac-VP28;
(3): chủng đột biến gen wzz không chứa Ptac-VP28;
(4): chủng V. har veyi hoang dại BL1; (5): thang protein
Harris L, Owens L, Smith S, 1996. A selective and
differential medium for Vibrio harveyi. Applied and
Environmetal Microbiology, 62: 3548-3550.
John M, Crean TI, Calderwood SB, and Ryan ET, 2000.
In Vitro and In Vivo Analyses of Constitutive and In
Vivo-Induced Promoters in Attenuated Vaccine and
Vector. Infection and immunity, 68: 1171-1175.
IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1. Kết luận
Đã tạo được chủng Vibrio harveyi đột biến gen
wzz bằng phương pháp knock-out gen và có khả
năng biểu hiện protein vỏ VP28 của vi rút gây bệnh
đốm trắng (WSSV) trên tôm.
Liu PC, Lee KK, Yii KC, Kou GH, Chen SN, 1996.
Isolation of Vibrio harveji from diseased kuruma
prawns Penaeus laponicils. Curr Microbiol, 33: 129-132.
Najdenski H1, Golkocheva E, Vesselinova
A, Bengoechea JA, Skurnik M, 2003. Proper
expression of the O-antigen of lipopolysaccharide is
essential for the virulence of Yersinia enterocolitica
O:8 in experimental oral infection of rabbits. FEMS
Immunology & Medical Microbiology, 38: 97-106.
Qi Y, Yi G, Wang Z, Yao L, Qian J and Hu L, 2004. VP28
of Shrimp White Spot Syndrome Virus Is Involved in
the Attachment and Penetration into Shrimp Cells.
Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 37:
726-734.
Rowley AF, Powell A, 2007. Invertebrate Immune
Systems-Specific, Quasi-Specific, or Nonspecific?.
e Journal of Immunology, 179:7209-7214.
4.2. Đề nghị
Đây là chủng vi khuẩn đột biến có tiềm năng bảo
vệ tôm kháng lại vi rút gây bệnh đốm trắng. Do đó,
cần triển khai các nghiên cứu về thử nghiệm độc lực
của chủng đột biến và đánh giá hiệu quả bảo vệ của
chủng này kháng lại WSSV.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Franco AV, Liu D, Reeves PR, 1998. e Wzz (Cld)
Protein in Escherichia coli: Amino Acid Sequence
Variation Determines O-Antigen Chain Length
Specificity. Journal of bacteriology, 180: 2670-2675.
Hernandez G, Olmos J, 2004. Molecular identification
of pathogenic and nonpathogenic strains of V.
harveyi using PCR and RAPD. Applied Microbiology
Biotechnology, 63: 722-727.
123
Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 7(92)/2018
Rowley AF, Powell A, Pope EC, 2011. Enhanced
immune defences in Pacific white shrimp
(Litopenaeus vannamei) post-exposure to a vibrio
vaccine. Journal of Invertebrate Pathology, 107: 95-9.
Sun L, Hu YH, Deng T, Sun BG, 2012. Development
and efficacy of an attenuated Vibrio harveyi
vaccine candidate with cross protectivity against
Vibrio alginolyticus. Fish & Shellfish Immunology,
32: 1155 -1161.
une RL, Fernandez DH, Battista JR, 2011. An
aroA Mutant of Edwardsiella ictaluri Is Safe and
Efficacious as a Live Attenuated Vaccine. Journal of
Aquatic Animal Health, 11: 358-372.
A mutant Vibrio harveyi strain knocked-out wzz gene expressing
the VP28 antigen of white spot syndrom virus
Mai u ao, Tran Pham Vu Linh, Ngo Huynh Phuong ao,
Lam Vy Nguyen, Nguyen Quoc Binh
Abstract
ere are many approaches to develop biological products which can protect shrimp from serious diseases. In this
study, we created a mutant Vibrio harveyi strain, the bacteria causes the luminescent disease on shrimp by knocking-
out wzz gene (O-antigen gene determinant chain length) and inserted VP28 gene encoding the envelop protein of the
virus WSSV causing White spots syndrome in gene knocking-out site. Firstly, HKTwzz cassette (ΔHKT) including
Hwzz sequence (the head of wzz gene); K (kanamycin resistance gene), Twzz (the tail of wzz gene) was generated by
PCR overlap. en Ptac-VP28 sequence was inserted into the site of NdeI enzyme located on the HKTwzz cassette.
e ΔHKTwzz::Ptac-VP28 cassette was inserted into pGP704 and cloned into E. coli SM10λpir. e mutant Vibrio
harveyi strain was generated by conjugating between the donor E. coli SM10λpir::pGP704::ΔHKT::Ptac-VP28 strain
and the wild type receipt of Vibrio harveyi BL1 strain (Bac Lieu province). e test of SDS-PAGE and Western Blot
showed that the mutant Vibrio harveyi strain have been able to express VP28 protein.
Key words: Conjugation, knock-out gene, pGP704, SM10λpir, Vibrio harveyi
Ngày nhận bài: 7/6/2018
Ngày phản biện: 15/6/2018
Người phản biện: TS. Lê Hồng Phước
Ngày duyệt đăng: 16/7/2018
124
8 trang
09/01/2024
11440
Free
Bạn đang xem tài liệu "Tạo chủng Vibrio harveyi đột biến gen WZZ có khả năng biểu hiện Protein vỏ VP28 của vi rút gây bệnh đốm trắng WSSV (White spot syndrome virus) trên tôm", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên
File đính kèm:
- tao_chungvibrio_harveyidot_bien_genwzzco_kha_nang_bieu_hien.pdf
