Nghiên cứu khả năng gây bệnh và gây đáp ứng miễn dịch của virut gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú nuôi ở Việt Nam
Nghiên cứu khả năng gây bệnh và gây đáp ứng miễn dịch của virut gây
bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú nuôi ở Việt Nam
Phạm Thị Tâm1, Phạm Công Hoạt2, Nguyễn Thị Thu Hiền1,
Vũ Tiến Lâm3, Nguyễn Thị Vui4 và Nguyễn Thị Thanh4
Tóm tắt
8 chủng virut gây bệnh hoại tử thần kinh (NNV) được sử dụng để nghiên cứu khả năng
gây bệnh và gây đáp ứng miễn dịch trên cá mú nuôi ở Việt Nam. Các chủng virut này có độc lực
khác nhau khi đánh giá mức độ gây bệnh trên tế bào mẫn cảm và cá mú con, với giá trị TCID50
đạt từ 10-2,7-10-3,9, LD50 đạt từ 10-1,5-10-7,5. Trong đó 4 chủng NNV ký hiệu QN 02, QN 05, QN
07, KH 05 đã được xác định có độc lực mạnh, gây chết 100% cá sau 3 ngày gây nhiễm. Đánh giá
khả năng gây miễn dịch của các chủng virut này đã xác định được chủng KH 05 có tính đại diện
kháng nguyên cao nhất, chủng này bị bất hoạt bởi formalin 0,3%. NNV KH 05 được nhũ hóa
bằng Montanide ISA 70 có thể tạo kháng thể trung hòa với NNV cường độc ở ngày thứ 15 trên
thỏ và kháng thể bảo hộ trên cá là 80- 85% ở ngày thứ 20 sau khi gây miễn dịch. Kết quả này là
cơ sở để sản xuất vacxin phòng bệnh hoại tử thần kinh.
Từ khóa: Cá mú, Virut gây bệnh hoại tử thần kinh (NNV), TCID50, LD50, Kháng thể trung
hòa, Kháng thể bảo hộ
Study on the pathogenicity and immune response of Nervous Necrosis Virus
(NNV) in grouper culture in Vietnam
Pham Thi Tam, Pham Cong Hoat, Nguyen Thi Thu Hien,
Vu Tien Lam, Nguyen Thi Vui and Nguyen Thi Thanh
Summary
Eight strains of Nervous Necrosis Virut (NNV) were used to study on pathogenecity and
inducing immune response in grouper being cultured in Vietnam. These virus strains having
different virulences obtained through assessment of pathogenous levels in susceptible cells and
grouper fry/fingerlings, with index TCID50 reached from 10-2,7 to 10-3,9, index LD50 reached from
10-1,5 to 10-7,5. Of which, four NNV strains namely QN 02, QN 05, QN 07, KH 05 were
determined to have high virulence, causing 100 % groupers died after 3 post infection. Evaluation
of inducing immune response of these virus strains was determined that KH 05 virus strain was
highest antigen representative. This virus strain was inactivated by formalin 0.3 %, NNV KH 05
was emulsified by Montanide ISA 70 that could generate antibody, neutralized with high
virulence NNV at day 15th in rabbits and antibody protected 80 – 85 % in groupers at day 20th
after inducing immunity. This result could be used as basis for producing vaccine against VNN
disease.
Key words: Grouper, Nervous Necrosis Virus (NNV), TCID50, LD50, Neutralizing antibody,
Protective antibody
----------------------------------------------------------------------------------------
1 Khoa C«ng nghÖ sinh häc, ViÖn §¹i häc Më Hµ Néi
2 Bé Khoa häc vµ C«ng nghÖ
3 Công ty Cổ phần phát triển Công nghệ Nông thôn-RTD
4
Khoa Nông lâm ngư, trường Đại học Vinh
1
I. Đặt vấn đề
Bệnh hoại tử thần kinh (Viral Nervous necrosis-VNN) do Nervous Necrosis Virut- NNV là
bệnh cấp tính, xuất hiện trên 22 loài cá, trong đó có các loài: cá mú (Epinephelus sp.), cá chình
(Anguilla anguilla), cá chẽm (Lates calcarifer), cá giò (Racycentron canadum). Bệnh chủ yếu
trên cá giống, gây tỷ lệ chết có thể lên đến 90 – 100%. Ở Việt Nam, virut này đã được phát hiện
thấy trên cá mú ngoài tự nhiên và cá chình nước ngọt [1,2].
Hầu hết những nghiên cứu về VNN đều cho thấy: mô đích của NNV là hệ thần kinh trung
ương (gồm não và tuỷ sống) và võng mạc [5]. Virut này gây hoại tử các nơron thần kinh dẫn đến
những biểu hiện bất thường như bơi không định hướng, chủ yếu theo hình trôn ốc hoặc lao thẳng,
nhanh về phía trước [4].
Hiện tại, việc phòng bệnh hoại tử thần kinh được thực hiện theo 2 hướng: Loại trừ con
giống mang mầm bệnh và sử dụng vacxin [3]. Nghiên cứu này được thực hiện nhằm mục đích
xác định khả năng gây đáp ứng miễn dịch của NNV trên cá mú để làm cơ sở cho sản xuất vacxin
sau này.
II. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
2.1. Đối tượng
8 chủng NNV ký hiệu là QN 02, QN 05, QN 07, HP 11, NĐ 01, NĐ 11, KH 05, KH 09
phân lập được từ cá mú mắc bệnh hoại tử thần kinh (VNN) thu thập từ các vùng biển Quảng
Ninh, Hải Phòng, Nam Định, Khánh Hòa.
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Nuôi cấy virut trên tế bào
NNV được nuôi bằng tế bào GS 1 (grouper spleen). Trước khi sử dụng, tế bào được hoạt
hóa trong chai nuôi cấy với môi trường Leibovitz’s L-15 (L 15) có bổ xung 10% huyết thanh bào
thai bê (FCS). Tế bào được nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 27oC, 5% CO2 trong 2 ngày để đạt mật độ
105 tế bào/ml.
Mẫu NNV được lây nhiễm trên tế bào GS 01 đã hoạt hóa. Chai đối chứng chỉ có tế bào GS
và môi trường L-15 có bổ sung 10% FCS.
Theo dõi hiệu ứng huỷ hoại tế bào (CPE-cytopathic effect) mỗi ngày. Khi CPE đạt khoảng
90-95% thu dịch virut khỏi chai nuôi cấy rồi ly tâm thu dịch nổi có chứa virut.
2.2.2. Chuẩn độ virut
* TCID50
Chuẩn độ virut được thực hiện trên đĩa nhựa 96 giếng nuôi tế bào GS 1.
Dịch virut được tiến hành pha loãng theo hệ số 10 trong môi trường Hank’s rồi bổ sung vào
các giếng tế bào. Virut được hấp phụ vào tế bào trong 2 giờ. Tiếp tục nuôi tế bào bằng Leibovitz’s
L-15 có 10% FCS.
Quan sát hiện CPE trong vòng 5 ngày đê xác định TCID50 theo phương pháp của Reed và
Muench.
* LD50
Cá mú con có kích thước 1,5 cm được chia thành 8 lô, mỗi lô 30 con gây nhiễm với 8
chủng VNN phân lập được từ các vùng biển Quảng Ninh, Hải Phòng, Nam Định, Khánh Hòa,
Bình Thuận. Lô đối chứng được tiêm Leibovitz’s L-15 10%.
+Phương pháp gây nhiễm: Dịch virut được pha loãng theo hệ số 10 trong môi trường
Leibovitz’s L-15 rồi tiêm 0,1ml/con.
2
+ Vị trí tiêm: Dưới gốc vây đuôi.
+ Thời gian theo dõi cá: bắt đầu từ 6 giờ đến 15 ngày sau khi gây nhiễm.
Sau tiêm truyền, quan sát các biểu hiện lâm sàng, tỷ lệ chết, kiểm tra gen mã hóa kháng
nguyên bề mặt.
LD50 được tính dựa theo phương pháp của Reed và Muench (1938).
2.2.3. Phương pháp gây bất hoạt virut
NNV được bất hoạt bởi formalin với 3 nồng độ: 0,1%; 0,3%; 0,5% ở nhiệt độ 37°C trong
12h. Sau 12h trung hòa formalin bằng sodium phosphate, thực hiện lắc dịch liên tục trong 24 giờ.
2.2.4. Phương pháp RT-PCR
ARN tổng số của NNV được tách bằng kit RNA extraction (Qiagen). ADN bổ sung
được tạo thành từ phản ứng RT- PCR với bộ kit RT-PCR (Invitrogen) và cặp mồi PCR F1
–R3 [4] (5’-GGATTTGGACGTGCGACCAA-3’; 5’-CGAGTCAACACGGGTGAAGA-
3’) (Invitrogen). Phản ứng được thực hiện với 30 chu kỳ theo các chu trình nhiệt: 900C/5
phút, 550C/45 giây, 720C/1 phút. Sau đó, phản ứng được tiếp tục ở 720C/10 phút.
2.2.5. Phương pháp ELISA trực tiếp
Phản ứng được thực hiện với kháng thể pha loãng trong dung dịch đệm carbonate, mỗi
giếng phủ 100l rồi ủ qua đêm ở nhiệt độ 40C; Dịch kháng nguyên pha loãng theo tỷ lệ 1/400
trong PBS, ủ ở nhiệt độ 370C/ 1 giờ; Goat anti-rabbit IgG HRPO (Sigma) pha loãng 1/10.000, ủ ở
nhiệt độ phòng trong 45 phút; cơ chất sinh màu TMB ủ trong 15 phút ở 370C và dừng phản ứng
bằng H2SO4 1M. Đọc kết quả phản ứng trên máy đọc đĩa ELISA, bước sóng 450nm.
III. Kết quả nghiên cứu
3.1 Nghiên cứu khả năng gây nhiễm của NNV
3.1.1 Xác định liều TCID50 của NNV trên tế bào mẫn cảm
Liều TCID50 của 8 chủng NNV thí nghiệm được xác định dựa trên mức độ hủy hoại tế bào
GS 1 sau 5 ngày gây nhiễm Kết quả trình bày trong bảng 1.
Bảng 1. Kết quả gây nhiễm virut trên tế bào GS 01
CPE theo các độ pha loãng virut (%)
Ký hiệu
STT
TCID50
mẫu
10-1
100
100
100
70
100
95
100
60
10-2
100
100
100
70
100
95
100
60
10-3
98
95
95
60
95
80
95
50
50
10-4
85
80
80
50
80
75
80
40
30
10-5
80
70
70
35
70
60
70
15
15
10-6
70
60
60
20
60
52
60
5
10-7
50
48
48
5
48
35
48
+
10-8 10-9
1
2
6
8
9
QN 02
QN 05
QN 07
HP 11
NĐ 01
25
10
10
10
+
10-6,9
10-6,8
10-6,8
10-3,9
10-6,8
10-5,9
10-6,8
10-3
25
25
+
25
20
25
-
10
5
10
-
12 NĐ 11
17 KH 05
19 KH 09
25 HP 11
55
55
5
+
-
-
10-2,7
3
3.1.2. Kết quả xác định liều gây chết và gây nhiễm 50% (LD50) trên cá mú
8 chủng virut phân lập được từ các vùng biển Quảng Ninh, Hải Phòng, Nam Định,
Khánh Hòa được sử dụng để gây nhiễm trên cá mú có kích thước 1,5cm. Theo dõi tỷ lệ cá
chết có biểu hiện lâm sàng của bệnh hoại tử thần kinh ở các lô thí nghiệm trong 15 ngày
đồng thời xác định gen mã hóa kháng nguyên của NNV để khẳng định sự có mặt của virut
trong các mẫu cá chết. Kết quả thí nghiệm được trình bày trong bảng 2.
4
Bảng 2: Kết quả gây nhiễm NNV trên cá mú con
Tỷ lệ chết cộng dồn sau 15 ngày (%) theo các độ pha loãng
Ký
Gen T2
hiệu
mẫu
(n=30)
virut
STT
LD50
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9
1
2
3
4
5
6
7
8
9
QN 02 100 100 100 100 80
QN 05 100 100 100 93,3 93,3 80
QN 07 100 100 100 80 80 73,3 60
NĐ 01 100 100 100 93,3 66,7 53,3 30
NĐ 11 100 100 100 86,7 86,7 66,7 53,3 30
60
53,3 13,3 13,3 10-6,2
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
-
66,7 53,3 33,3 10-7,5
46,7 40
26,6 13,3 10-5,5
15
10-6,5
10-7,5
KH 05 100 100 100 73,3 66,7 53,3 53,3 13,3 13,3 10-6,2
KH 09 80
HP 11 66,7 53,3 30
ĐC
80
53,3 26,6 13,3 6,7 6,7
0
0
0
0
0
0
10-2,6
10-1,5
nd
13,3 6,7 6,7 6,7
0
0
0
0
0
0
0
Ghi chú: nd: không tính toán, gen T2: gen mã hóa kháng nguyên của NNV [4] +: dương tính với gen T2, -: âm tính với gen T2,
ĐC: tiêm Leibovitz’s L-15
5
8 chủng NNV tiếp tục được gây nhiễm cho cá mú con với liều LD50 để đánh
giá độc lực của virut thông qua mức độ gây chết cá tại các thời điểm theo dõi thí
nghiệm. Các mẫu cá chết có biểu hiện của bệnh hoại tử thần kinh được giám định
đồng thời gen T2.
Bảng 3. Kết quả gây nhiễm cá mú con với các chủng NNV đã phân lập
Tỷ lệ chết tích lũy (%) theo thời gian gây nhiễm
Bố trí lô thí
nghiệm (n=30)
(h)
72
100
100
100
40
63,3
100
33
LD50
Gen T2
24
13,3
23,3
26,7
16,7
23,3
30
36
96
120
10-6,2
10-7,5
10-7,5
10-5,5
10-6,5
10-6,2
10-2,6
10-1,5
QN 02
QN 05
QN 07
NĐ 01
NĐ 11
KH 05
KH 09
HP 11
46,7
63,3
50
23,3
43,3
36,7
16,7
+
+
+
+
+
+
+
+
56,7
83,3
73,3
100
10
40
75
72
3,3
13,3
30
46,7
nd
Đối chứng âm
0
0
0
6,67
6,67
-
(n=15)
Kết quả trình bày trong bảng 3 cho thấy, ở lô đối chứng âm, 1 cá bị chết khi
được tiêm Leibovits L15 10%, tỷ lệ chết cộng dồn sau 120 giờ là 6,67%, kiểm tra
gen T2 cho kết quả âm tính.
Có 4/8 chủng gây chết 100% cá ở thời điểm 72 giờ là các chủng QN 02, QN
05, QN 07 và KH 05, 1 chủng gây chết 100% cá ở thời điểm 120 giờ là NĐ 11, 3
chủng gây chỉ gây chết 72-75% cá ở thời điểm 120 giờ là các chủng NĐ 01, KH
09, HP 11. Như vậy, 4 chủng ký hiệu QN 02, QN 05 QN 07 và KH 05 có độc lực
mạnh hơn các chủng còn lại, các chủng này được sử dụng trong phản ứng trung
hòa để kiểm tra kháng thể ở động vật thí nghiệm được tiêm NNV.
3.2. Nghiên cứu khả năng gây đáp ứng miễn dịch của NNV
3.2.1. Kết quả nghiên cứu khả năng gây đáp ứng miễn dịch của NNV trên thỏ
8 chủng NNV phân lập được trên cá mú ở các tỉnh Quảng Ninh, Hải
Phòng, Nam Định và Khánh Hòa được sử dụng để gây đáp ứng miễn dịch trên thỏ
nhằm 2 mục đích: i) lựa chọn được chủng đại diện kháng nguyên, ii) đánh giá khả
năng trung hòa virut cường độc của kháng thể thu được.
3.2.1.1. Kết quả lựa chọn chủng NNV đại diện kháng nguyên
Chủng đại diện kháng nguyên là chủng phải đạt ít nhất 2 tiêu chí: i) có khả
năng kích thích sinh đáp ứng miễn dịch nhanh, mạnh nhất, ii) kháng thể sinh ra bởi
chủng này phải nhận biết được nhiều chủng virut NNV khác nhau.
Để lựa chọn được chủng này, chúng tôi đã tiêm NNV vào thỏ thí nghiệm
với 2 lần nhắc lại ở các ngày thứ 7 và 15. Theo dõi biến động hiệu giá kháng thể
trên thỏ bằng phản ứng ELISA. Kết quả thí nghiệm được trình bày trong đồ thị 1.
76
1.6
1.4
1.2
1
QN02
QN05
QN07
NĐ01
0.8
0.6
0.4
0.2
0
NĐ11
KH05
KH09
HP11
Đối chứng âm (L15)
d0
d7
d15
d21
d35
d45
d60
số ngày
Đồ thị 1. Biến động kháng thể trong máu thỏ được tiêm NNV (ELISA OD450)
Kết quả trong đồ thị cho thấy chủng KH 05, KH 09, QN 07 có khả năng gây
đáp ứng miễn dịch nhanh và mạnh hơn cả trên thỏ thí nghiệm, các chủng còn lại
gây đáp ứng chậm và kém hơn. Do đó, kháng thể của 3 chủng KH 05, KH 09, QN
07 được lựa chọn để kiểm tra khả năng nhận biết chéo với các chủng virut gây
bệnh hoại tử thần kinh khác nhau nhằm tìm ra mẫu kháng thể nhận biết nhiều
chủng NNV nhất . Thí nghiệm này được thực hiện bởi phản ứng ELISA trực tiếp.
Kết quả trình bày trong bảng 4.
Bảng 4. Kết quả kiểm tra khả năng phát hiện chéo các chủng NNV của
kháng thể đặc hiệu với 3 chủng KH 05, KH 09, QN 07 (ELISA OD450=1,2)
Kháng thể
KH 05
KH 09
QN 07
Chủng virut
KH 05
KH 09
QN 07
QN 02
QN 05
NĐ 01
NĐ 11
HP 11
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
+
+
Kết quả phản ứng ELISA trực tiếp cho thấy, kháng thể đặc hiệu với hai
chủng KH 05 và KH 09 có khả năng gây phản ứng chéo với 7 chủng còn lại, trong
khi đó kháng thể của chủng QN 07 lại không phát hiện được 2 chủng NNV phân
lập được tại Khánh Hòa. Có thể chủng QN 07 thuộc phân typ khác của NNV.
Từ kết quả ở bảng 2 và biểu đồ 1, chủng KH 05 được chúng tôi lựa chọn
làm chủng đại diện kháng nguyên vì chủng này đạt được 2 tiêu chí: có khả năng
kích thích sinh đáp ứng miễn dịch nhanh, mạnh nhất và kháng thể sinh ra bởi KH
05 nhận biết được nhiều chủng virut NNV khác nhau.
NNV KH 05 được bất hoạt bởi formalin ở các nồng độ: 0,1%; 0,3% và
0,5%. Sau 5 ngày bất hoạt và trung hòa bởi sodium phosphate, virut được tiêm
77
truyền trở lại trên cá mú để đánh giá mức độ bất hoạt. Kết quả thí nghiệm thu được
trình bày trong bảng 5:.
Bảng 5. Kết quả đánh giá mức độ bất hoạt của NNV ở các nồng độ formalin
Nồng độ
Formalin
(%)
Số
con/lô
Biểu hiện cá tiêm truyền virut sau
Gen T2
Liều tiêm
khi xử lý bằng formalin
Bơi không định hướng trong 3
0,1ml/con ngày đầu, sau đó bơi đứng, bỏ ăn;
100% lô cá bị chết sau 7 ngày
+
0,1%
15
Cá bình thường, không có biểu
0,3%
0,5%
15
15
0,1ml/con
-
-
hiện đặc biệt
Cá bình thường, không có biểu
0,1ml/con
hiện đặc biệt
Kết quả thí nghiệm cho thấy, 100% cá chết sau 7 ngày tiêm truyền dịch virut được xử lý
formalin 0,1%, cho kết quả dương tính với gen T2. Như vậy, nồng độ formalin 0,1% không gây
bất hoạt hoàn toàn đối với chủng NNV KH 05.
Ở hai lô virut được xử lý formalin 0,3% và 0,5% chúng tôi không phát hiện cá chết cũng
như các triệu chứng của bệnh hoại tử thần kinh. Bằng phản ứng RT-PCR, đoạn gen T2 cũng
không được phát hiện trên cá gây nhiễm. Như vậy hai nồng độ này đã bất hoạt hoàn toàn chủng
NNV KH 05.
Từ kết quả trên cho phép chúng tôi xác định rằng, nồng độ formalin 0,3% thích hợp để
bất hoạt virut, phục vụ gây miễn dịch cho cá thí nghiệm.
3.2.1.2. Kết quả đánh giá khả năng trung hòa NNV cường độc của kháng thể thu được trên thỏ
Phản ứng trung hòa được thực hiện với 3 chủng virut cường độc ký hiệu là QN 02, QN
05 và QN 07 và kháng thể thu được từ thỏ gây miễn dịch với chủng KH 05. Định kỳ thu huyết
thanh của thỏ để làm phản ứng trung hòa với 03 chủng virut NNV cường độc. Các mẫu kháng thể
và virut được ủ trong 6 giờ, 370C rồi tiêm trở lại cá mú sạch bệnh. Theo dõi cá trong 3 ngày, kết
quả trung hòa virut được đánh giá bằng tỷ lệ các nhiễm bệnh và chết được trình bày trong bảng 6.
Bảng 6. Kết quả trung hòa các chủng NNV cường độc của kháng thể kháng NNV KH 05
Ngày thu huyết thanh
Tên Tỷ lệ cá mắc bệnh/ chết
chủng
(%)
d0
d7
d15
20
0
d21
5
d35
0
d45
0
d60
0
Tỷ lệ cá mắc bệnh (%)
Tỷ lệ cá chết (%)
100
100
100
100
100
100
QN 02
(n=20)
0
0
0
0
Tỷ lệ cá mắc bệnh (%)
25
10
0
0
0
QN 05
(n=20)
Tỷ lệ cá chết (%)
100
75
0
0
0
0
0
Tỷ lệ cá mắc bệnh (%)
Tỷ lệ cá chết (%)
100
100
100
90
35
5
5
0
0
0
0
0
0
0
QN 07
(n=20)
Ghi chú: d: ngày thu huyết thanh thỏ
78
Số liệu trong bảng 6 cho thấy, kháng thể trung hòa ở thỏ được sinh ra từ ngày thứ
35 sau khi gây miễn dịch bằng NNV, 100% cá được tiêm dịch virut trung hòa không bị
chết với triệu chứng của bệnh hoại tử thần kinh, cũng như không bị nhiễm NNV (giám định
bằng sự có mặt của gen T2 trong mô não cá và quan sát triệu chứng lâm sàng). Ở ngày thứ
15, tỷ lệ cá chết và mắc bệnh có sự sai khác ở 03 chủng thí nghiệm, chênh lệch giữa tỷ lệ cá
mắc bệnh và chết từ 20-30% .
3.2.2. Đánh giá khả năng tạo đáp ứng miễn dịch của NNV trên cá mú
Chủng NNV KH 05 bất hoạt được nhũ hóa bằng dầu Montanide ISA70 rồi gây
đáp ứng miễn dịch cho cá mú 3 lần ở các ngày thứ 1, 7, 10 với liều 0,1 ml/con (hiệu giá
virut là 10-6,2) , lô đối chứng tiêm L15 10%. Sau khi gây miễn dịch, cá mú được công
cường độc bởi các chủng QN 02, QN 05, QN 07 để đánh giá khả năng tạo đáp ứng miễn
dịch của cá với NNV. Kết quả thí nghiệm được thể hiện ở bảng 7:
Bảng 7: Kết quả tạo đáp ứng miễn dịch của NNV trên cá mú
Ngày công cường độc (n=20)
Tỷ lệ cá mắc bệnh/ chết
Tên chủng
(%)
d15 d20
d25
25
D30 d35
d40
15
d45
15
Tỷ lệ cá mắc bệnh (%)
Tỷ lệ cá chết (%)
30
15
25
10
20
15
20
10
QN 02
15
10
10
Tỷ lệ cá mắc bệnh (%)
Tỷ lệ cá chết (%)
35
25
25
15
20
10
15
10
15
10
15
10
15
10
QN 05
QN 07
Tỷ lệ cá mắc bệnh (%)
Tỷ lệ cá chết (%)
30
25
20
15
20
20
15
15
15
15
15
10
15
10
Theo số liệu trong bảng 7, NNV bất hoạt đã tạo ra kháng thể trong cá thí nghiệm.
Ở ngày thứ 15, kháng thể sinh ra bảo hộ được 65-70% cá bị công cường độc. Từ ngày thứ
20-30 kháng thể sinh ra bảo hộ được 80-85% cá bị công cường độc. Lô đối chứng tiêm
virut bất hoạt nhưng không công cường độc đã không phát hiện thấy gen T2 có trong não
cá (số liệu không thể hiện trong bảng 7), chứng tỏ cá bị bệnh ở các lô thí nghiệm là do các
chủng cường độc QN 02, QN 05, QN 07. Kết quả này chỉ ra rằng có thể sản xuất được
vacxin phòng bệnh hoại tử thần kinh cho tỷ lệ bảo hộ cao hơn nếu như lựa chọn liều kháng
nguyên và số lần tiêm nhắc lại phù hợp.
IV. Kết luận và đề nghị
- Đã xác định được liều TCID50, LD50 của 8 chủng virut gây bệnh hoại tử thần kinh
trên cá mú, mức độ gây nhiễm của các chủng khác nhau, trong đó có 4 chủng có độc lực
mạnh hơn cả là QN 02, QN 05, QN 07 và KH 05.
- Đã lựa chọn được chủng đại diện kháng nguyên là KH 05. Chủng virut này bị bất
hoạt bởi formalin 0,3%.
- NNV KH 05 bất hoạt tạo kháng thể trung hòa với NNV cường độc ở ngày thứ 15
trên thỏ và kháng thể bảo hộ trên cá là 80- 85% ở ngày thứ 20 sau khi gây miễn dịch.
79
Đề nghị nghiên cứu lặp lại để có cơ sở vững chắc cho SX vacxin. Đề nghị nghiên
cứu sản xuất vacxin vô hoạt nhũ dầu để phòng bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú.
Tài liệu tham khảo
1. Phạm Thị Tâm, Phạm Công Hoạt (2011). Phát hiện, phân lập và xác định một số đặc
tính của virut gây bệnh hoại tử thần kinh (Nervous Necrosis Virus) trên cá mú tự nhiên tại
vùng biển Quảng Ninh. Tạp chí Nông nghiệp và PTNT, ISSN 0866-7020, số 20, 2011.
2. Phạm Thị Tâm, Phạm Công Hoạt, Nguyễn Thị Vui, Nguyễn Thị Thanh, Nguyễn
Quang Linh (2012). Xác định virut gây bệnh hoại tử thần kinh (Nervous Necrosis Virut)
trên cá chình nuôi tại vùng biển miền Trung. Tạp chí Nông nghiệp và PTNT, ISSN 0866-
7020, số 12, 2012.
grouper nervous necrosis virus by vaccination of virus-like particles. Vaccine 24(37-
39):6282-7
4. Renault, T., Haffner, P., Baudin, L.F., Breuil, G., Bonami, J.R., 1991. Mass
mortalities in hatchery-reared sea bass Lates calcarifer larvae associated with the
presence in the brain and retina of virus-like particles. Bull. Eur. Assoc. Fish
Pathol. 11, 68–73.
80
10 trang
09/01/2024
780
Bạn đang xem tài liệu "Nghiên cứu khả năng gây bệnh và gây đáp ứng miễn dịch của virut gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú nuôi ở Việt Nam", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên
File đính kèm:
- nghien_cuu_kha_nang_gay_benh_va_gay_dap_ung_mien_dich_cua_vi.pdf
