Kết quả thiết lập phản ứng trung hòa Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) sử dụng chủng thực địa phân lập tại miền Bắc
Vietnam J. Agri. Sci. 2020, Vol. 18, No. 7: 475-484
Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 2020, 18(7): 475-484
KẾT QUẢ THIẾT LẬP PHẢN ỨNG TRUNG HÒA PORCINE EPIDEMIC DIARRHEA VIRUS (PEDV)
SỬ DỤNG CHỦNG THỰC ĐỊA PHÂN LẬP TẠI MIỀN BẮC
Nguyễn Thị Bích1*, Trần Văn Khánh1, Nguyễn Thanh Ba1, Chu Thị Thanh Hương2
1Công ty TNHH Dược Hanvet
2Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam
*Tác giả liên hệ: Bichvn8078@gmail.com
Ngày nhận bài: 18.05.2020
Ngày chấp nhận đăng: 23.06.2020
TÓM TẮT
Nghiên cứu được thực hiện nhằm thiết lập phản ứng trung hòa sử dụng chủng virus thực địa để làm công cụ
đánh giá khả năng bảo hộ của vacxin chống lại các chủng PEDV gây bệnh lưu hành tại Việt Nam. Bằng cách lựa
chọn môi trường DMEM không chứa huyết thanh bào thai bê (FBS), không chứa trypsin để pha mẫu phản ứng, pha
hỗn dịch virus, lựa chọn môi trường duy trì chứa 8µg trypsin/ml đã tối ưu được quy trình trung hòa virus, tối ưu cách
đánh giá kháng thể trung hòa bằng phương pháp nhuộm hóa miễn dịch trên tế bào một lớp, kết quả thí nghiệm cho
thấy phản ứng trung hòa virus thực địa có độ nhạy 87,46% và độ đặc hiệu 98,18% khi so sánh với phản ứng ELISA
phát hiện kháng thể đặc hiệu lớp IgG. Ứng dụng phản ứng trung hòa phát hiện biến động kháng thể trung hòa PEDV
ở mẫu sữa đầu và huyết thanh của lợn nái và lợn con theo mẹ.
Từ khóa: Porcine epidemic diarrhea virus, phản ứng trung hòa virus.
Establishing Virus Neutralizing Test Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV)
using Isolated Field Strains in the North of Viet Nam
ABSTRACT
The study aimed to establish a virus neutralization test for field isolated virus, create a tool for assessing the
protection of vaccines against pathogenic porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) strains in Vietnam. By using
DMEM medium free calf fetal serum (FBS) and without trypsin for dilution sample preparation/viral suspensions, and
the maintenance medium containing 8 µg of trypsin/ml, the virus neutralization test and evaluation of neutralizing
antibodies by immunochemical staining on monolayer cells were optimized. The results showed that the virus
neutralization test for field isolated virus with the sensitivity of 87.46% and specificity 98.18% with compared to ELISA
kit. It also pointed out that the virus neutralization test could be applicated to detect fluctuation of PEDV neutralization
antibody in colostrum and serum of mother and piglets.
Keywords: Porcine epidemic diarrhea virus, virus neutralizing test (VNT).
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
PEDV gây ra xây ra rûng khíp Ċ châu Âu trong
nhąng nëm 1970 đến nëm 1980. TĂ nëm 1980
đến nëm 1990, sø ù dðch giâm dæn Ċ châu lĀc này.
Nëm 2013 bệnh læn đæu tiên bùng phát Ċ châu
giĉi vĉi MĐ. Phân tích di truyền cho thçy hæu hết
virus phân lêp Ċ châu Á và châu MĐ thuûc nhóm
mĉi nùi G2b, nìm Ċ nhánh khác hoàn toàn vĉi
chþng virus thuûc nhòm G1 thāĈng dùng chế
Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV)
thuûc hõ Coronaviridae, giøng Alphacoronavirus
là nguyên nhân gây tiêu chây cçp và mçt nāĉc
đæu tiên trên thế giĉi vào nëm 1971 täi mût ù
dðch tiêu chây cçp Ċ Anh. Đến nëm 1977 bệnh
tiêu chây trên lČn xây ra nghiêm trõng täi Bî,
chþng virus phân lêp đāČc vĉi tên gõi CV777
475
Kết quả thiết lập phản ứng trung hòa Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV) sử dụng chủng thực địa phân lập tại
miền Bắc
xuçt hiện bệnh PED muûn so vĉi các nāĉc trong
khu vĆc. PED chính thăc đāČc phát hiện tĂ nëm
2008, đāČc xác đðnh có quan hệ gæn vĉi các chþng
truyền cþa PEDV Ċ miền Bíc và Bíc Trung Bû,
biến đùi, kể tĂ nëm 2010, đã cò sĆ biến đùi cþa
chāćng trình düng vacxin PED đæy đþ trên lČn Ċ
các cć sĊ chën nuöi, nhāng dðch tiêu chây do
PEDV vén xây ra. Ở Việt Nam, cho đến thĈi
điểm hiện täi, vacxin thāćng mäi chþ yếu là
vacxin vô hoät hoặc nhāČc đûc dĆa vào các chþng
thuûc nhóm cù điển nhā: CV777, DR13, SM98.
Công ty Hanvet cung cçp. Chþng virus này đã
giám đðnh là PEDV, thuûc nhóm di truyền G2
không täp TGEV, Rotavirus theo phāćng pháp
PEDV 0118 là: có hiệu giá 106,1 TCID50/ml, có
đûc lĆc khi gây chết 5/5 lČn 2 ngày tuùi vĉi liều
104,5 TCID50/ml/ con theo đāĈng uøng. Chþng
virus đāČc chia nhó và bâo quân Ċ -80C. Chuèn
đû ngāČc (back titration) Ċ múi læn thĆc hiện
phân ăng nhìm đâm bâo hiệu giá virus thĆc
düng dao đûng xung quanh 100 TCID50/100µl.
- Huyết thanh lČn (nái, lČn con theo mẹ) Ċ
träi åm tính và dāćng tính PEDV, sąa đæu cþa
lČn nái;
Protein S cþa PEDV cò vai trñ kích thích cć
thể vêt chþ sinh kháng thể trung hña, đ÷ng thĈi
giúp virus tiếp cên và xâm nhêp vào tế vào vêt
Do đò, phân ăng trung hña là phāćng pháp gián
tiếp đánh giá tình träng miễn dðch chøng läi
trung hòa 5 log2 có khâ nëng bâo hû chøng läi
nhóm cù điển, các chþng PEDV thuûc nhóm mĉi
nùi đāČc chăng minh đề kháng cao vĉi
interferon và không bð trung hòa bĊi kháng thể
thçy đáp ăng miễn dðch täo ra chî có khâ nëng
bâo hû đ÷ng chþng. Do đò tāćng quan giąa bâo
hû và hiệu giá kháng thể trung hòa cæn dĆa trên
chþng virus hiện lāu hành Ċ thĆc đða. Để góp
phæn xây dĆng công cĀ giám sát lāu hành huyết
thanh hõc và đánh giá khâ nëng bâo hû cþa víc
xin, phân ăng trung hòa PEDV vĉi chþng virus
phân lêp thĆc đða cæn đāČc thiết lêp.
- Dòng tế bào Vero (ATCC - CCL-81);
- Möi trāĈng: Dulbecco's Modified Eagle
Medium (DMEM- Gibco), huyết thanh bào thai
bò (FBS-Gibco); Tryptose Phosphate Broth
(TBP-Merck); Yeast extract (YE-Merck);
Trypsin 1: 250 (Gibco);
- Sinh phèm, hóa chçt dùng nhuûm IPMA:
anti-
PEDV
monoclonal
antibody
(Median Diagnostics Inc), HRP- conjugated goat
anti- mouse IgG (US Biological); N, N-
Dimethylformamide (Sigma); cć chçt 3-amino-
9-ethylcarbazole (AEC- Sigma);
- PBS 1X, pH 7,2;
- Bû kít tùng hČp cDNA (MMLV reverse
transcriptase, Promega, M1705), kít PCR
(GoTaq G2 Hot Start Master, Promega, M7423);
các bû m÷i đặc hiệu giám đðnh genogroup
PEDV, phát hiện TGEV, Rotavirus đāČc lçy
- Bû kít ELISA (đāČc thiết lêp theo tiêu
chuèn cć sĊ) phát hiện kháng thể kháng protein
S cþa PEDV;
2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
- DĀng cĀ và thiết bð: đïa nuöi tế bào 96
giếng, đïa làm phân ăng ELISA, tþ nuôi çm 5%
CO2, kính hiển vi soi ngāČc, máy đõc ELISA;
máy PCR.
- Chþng PEDV 0118 phân lêp tĂ lČn con
theo mẹ míc tiêu chây cçp do phòng thí nghiệm
476
Nguyễn Thị Bích, Trần Văn Khánh, Nguyễn Thanh Ba, Chu Thị Thanh Hương
virus so vĉi đøi chăng âm. Hiệu giá kháng thể
trung hòa là sø nghðch đâo cþa đû pha loãng cao
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Thiết lập phản ứng trung hòa PEDV
nhçt mà Ċ đû pha loãng đò dāćng tính. Méu
đāČc coi dāćng tính khi hiệu giá kháng thể
trung hòa ≥8 (Chen & cs., 2016). Nhąng báo cáo
khác thçy rìng 90% sø lČn nghiên cău có hiệu
giá kháng thể trung hòa ≥20, nên ngāċng dāćng
cs., 2015; Chen & cs., 2016).
Phāćng pháp trung hña virus đāČc thiết lêp
vĉi sĆ điều chînh tĂ các tài liệu đã mö tâ trāĉc
dĆa trên loät huyết thanh lČn dāćng tính và
huyết thanh âm tính vĉi kháng thể kháng
PEDV. Các méu này đāČc chõn tĂ bû huyết
thanh theo tiêu chuèn cć sĊ. CĀ thể, huyết
thanh đāČc thu thêp Ċ lČn tĂ 2 trang träi: mût
trang träi lČn không có tiền sĄ bệnh tiêu chây
do virus, xét nghiệm virus hõc âm tính vĉi
PEDV; trang träi còn läi đã tĂng míc PED, có
kết quâ xét nghiệm dāćng tính vĉi PEDV bìng
phāćng pháp RT-PCR vĉi cặp m÷i đặc hiệu đāČc
thanh đāČc bçt hoät Ċ 56C/30 phút và khîng
đðnh chíc chín dāćng tính hoặc âm tính kháng
thể kháng PEDV bìng phân ăng ELISA cć sĊ.
2.2.2. Phương pháp ELISA phát hiện kháng
thể kháng PEDV
Để làm cć sĊ tính đû nhäy và đû đặc hiệu
cþa phân ăng trung hòa, nghiên cău này chõn
phân ăng ELISA (phát hiện kháng thể lĉp IgG)
làm tham chiếu. Kít ELISA đã thiết lêp theo
tiêu chuèn cć sĊ (ELISA cć sĊ) đāČc đánh giá đû
nhäy/đặc hiệu vĉi kít ELISA thāćng mäi
SwinecheckPED indirect, BioVet (không trình
bày). Các bāĉc thĆc hiện tóm tít nhā sau: chþng
PEDV 0118 cāĈng đûc phþ đïa Ċ hiệu giá 104,2
TCID50/ml trong coating buffer (pH = 9,6) Ċ 4C
trong 12 giĈ; huyết thanh chèn đoán đāČc pha
1/200 trong sąa tách bć 3% - PBS - Tween 20
0,05%; kháng thể kháng lČn gín enzyme đāČc
pha 1/1.200 trong sąa tách bć 3% - PBS - Tween
20 0,05%. Giąa các bāĉc, þ Ċ nhiệt đû 37C,
trong vòng 60 phút; rĄa 3 læn bìng dung dðch
PBS - Tween 20 0,05% để loäi bó các thành
phæn khöng đặc hiệu. Méu có giá trð ngāċng
OD450 <0,225 đāČc xác đðnh âm tính vĉi kháng
thể kháng PEDV.
Huyết thanh cæn xác đðnh hiệu giá kháng
thể trung hña đāČc pha loãng liên tiếp theo cć sø
2. Múi đû pha loãng đāČc trûn vĉi thể tích virus
cø đðnh (hiệu giá 100 TCID50/100µl) theo tď lệ
1:1. Ủ huyễn dðch huyết thanh: virus Ċ 37C/5%
CO2 trong vòng 1 giĈ 30 phút. Chuyển 100µl hún
dðch huyết thanh: virus vào tế bào Vero 1 lĉp
(đã đāČc rĄa 3 læn bìng PBS- 1X). Sau thĈi gian
hçp phĀ 1 giĈ 30 phút, hút bó dðch huyễn dðch,
rĄa tế bào 3 læn và thêm 100µl DMEM duy trì
có TPB (0,3%), YE (0,02%) và trypsin (8 µg/ml).
Xác đðnh giếng có kháng thể trung hòa
dāćng tính bìng phāćng pháp hòa miễn dðch,
phân ăng miễn dðch trên tế bào mût lĉp, cø đðnh
thâm tế bào bìng dung dðch PBS chăa 10%
Formalin và 1% NP40, sau đò thêm kháng thể
đặc hiệu PEDV (anti- PEDV monoclonal
antibody - Median Diagnostics Inc), rĄa đïa
phân ăng, thêm kháng thể cûng hČp (HRP-
conjugated goat anti- mouse IgG (US
Biological), thêm cć chçt AEC. Tế bào nhiễm
virus đặc hiệu khi quan sát qua kính hiển vi soi
ngāČc nguyên sinh chçt cþa tế bào bít màu đó
cþa cć chçt AEC. Đõc kết quâ trung hòa theo mô
đû giâm 90% sø tế bào/sø cĀm tế bào nhiễm
2.2.3. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của
phản ứng trung hòa virus
Phân ăng ELISA đāČc dùng làm tiêu chuèn
để đøi chiếu kết quâ cþa phāćng pháp trung hña
virus đāČc thiết lêp. CĀ thể, múi méu huyết
thanh sẽ đāČc phân tích læn lāČt bìng phân ăng
ELISA cć sĊ và phân ăng trung hòa virus. Møi
tāćng quan giąa giá trð OD450 cþa ELISA cć sĊ
và hiệu giá trung hña đāČc xác đðnh bìng giá trð
R (Pearson Correlation Coefficient), tính theo
com/tests/pearson/default2.aspx. Cách tính đû
nhäy và đû đặc hiệu cþa phāćng pháp đāČc
trình bày Ċ bâng 1.
477
Kết quả thiết lập phản ứng trung hòa Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV) sử dụng chủng thực địa phân lập tại
miền Bắc
Bâng 1. Cách tính độ nhạy, độ đặc hiệu của phân ứng trung hòa
Kết quả ELISA cơ sở
Kết quả phản ứng trung hòa
Số mẫu dương tính
Số mẫu âm tính
Số mẫu dương tính
Số mẫu âm tính
TP
FN
FP
TN
Ghi chú: TP: dương tính thêt, FP: dương tính giâ, TN: âm tính thêt, FN: âm tính giâ
Bâng 2. Hiệu giá trung hòa ở các môi trường bổ sung trypsin voiw nồng độ khác nhau
Nồng độ trypsin ở mỗi loại môi trường
Loại huyết thanh
Môi trường pha virus/ huyết thanh
Môi trường duy trì
0 µg/ml
8 µg/ml
KXĐ
10 µg/ml
KXĐ
Huyết thanh dương
Huyết thanh âm
0 µg/ml
0
0
0
0
Huyết thanh dương
Huyết thanh âm
8 µg/ml
6 log2
KXĐ
KXĐ
0
(bong 10%)
KXĐ
(bong 30%)
KXĐ
Huyết thanh dương
Huyết thanh âm
10 µg/ml
6 log2
0
(bong 20%)
(bong 50%)
Ghi chú: KXĐ: Không xác định được hiệu giá kháng thể do thâm tế bào bị co tròn và bong hoặc CPE xuçt hiện
không theo quy luêt.
Xác đðnh đû nhäy (phát hiện đýng khi cò
kháng thể) theo công thăc: Sn = TP/(TP + FN) ×
100; xác đðnh đû đặc hiệu (không phát hiện khi
không có mặt kháng thể) theo công thăc Sp =
TN/(TN + FP) × 100.
chuèn âm læn lāČt là 6 log2 và 0. Bâng 2 còn cho
biết lāČng trypsin trong möi trāĈng duy trì (8
µg/ml hoặc 10 µg/ml) không làm thay đùi hiệu
giá trung hòa cþa méu huyết thanh và thâm tế
bào ùn đðnh. Hàm lāČng trypsin này phù hČp vĉi
hàm lāČng trypsin trong möi trāĈng phân lêp
virus trên tế bào Vero mà các tác giâ trāĉc đã sĄ
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quâ tối ưu môi trường của phân
ứng trung hòa
Nghiên cău trāĉc đåy đã khîng đðnh trong
möi trāĈng duy trì để phân lêp virus không thể
vì sĆ có mặt cþa trypsin và không thể giúp virus
nhån lên. Đã cò nhiều công bø khoa hõc ăng dĀng
phân ăng trung hña virus nhāng khöng nêu rô
thành phæn möi trāĈng dùng cho múi bāĉc cþa
đāČc công bø, möi trāĈng DMEM bù sung 1 µg/ml
trypsin đāČc düng chung để pha virus/huyết
Tuy nhiên, chþng virus dùng trong nghiên cău
kể trên đã thích nghi cao đû trên möi trāĈng tế
Phân ăng trung hòa sĄ dĀng chþng PEDV
0118 phân lêp thĆc đða đāČc thiết lêp dĆa trên
cć sĊ các thí nghiệm: tøi āu möi trāĈng pha
loãng virus, pha loãng huyết thanh; tøi āu möi
trāĈng duy trì tế bào Vero khi nhiễm hún dðch
trung hòa. Bâng 2 trình bày kết quâ tøi āu n÷ng
đû trypsin cþa möi trāĈng dùng trong phân ăng.
Kết quâ cho thçy möi trāĈng dùng pha
virus/huyết thanh chèn đoán có trypsin (8 µg/ml
hoặc 10 µg/ml) đều dén tĉi hiện tāČng tế bào
trong giếng co tròn và bong tĂ 10-50%. NgāČc
läi, möi trāĈng pha virus/huyết thanh không có
trypsin, thâm tế bào không bong, hiệu giá trung
hòa virus cþa méu huyết thanh chuèn dāćng,
478
Nguyễn Thị Bích, Trần Văn Khánh, Nguyễn Thanh Ba, Chu Thị Thanh Hương
bào (tiếp đĈi 70 læn), do đò ít phĀ thuûc vào
bð ngën cân bĊi hoät đûng cþa huyết thanh chèn
giâi việc chî cæn cò trypsin trong giai đoän duy trì
tế bào nhiễm mà không cæn bù sung trypsin
trong giai đoän tāćng tác giąa virus và kháng thể
đặc hiệu là phù hČp.
trypsin. NgāČc läi, nghiên cău này dùng chþng
PEDV có sø læn tiếp đĈi thçp (đĈi 7), nên đñi hói
lāČng trypsin cao gçp 10 læn mĉi giýp xác đðnh
đāČc kết quâ cþa phân ăng mût cách rõ ràng.
Khác vĉi các virus khác thuûc nhóm
Alphacoronavirus cþa hõ Coronaviridae, trypsin
khöng đòng vai trñ hoät hòa PEDV trāĉc khi
virus gín vào tế bào vêt chþ hoặc tế bào Vero, mà
trypsin chî có vai trò giúp virus xâm nhêp khi
hČp bào và tëng hiệu giá virus khi virus hçp phĀ
vào tế bào Vero trong möi trāĈng không có
trypsin mà chî có trypsin bù sung trong môi
mà trypsin không thể bù sung vào möi trāĈng
pha virus và huyết thanh vì trypsin bð kìm chế,
3.2. Kết quâ thiết lập phương pháp đọc kết
quâ phân ứng trung hòa
PEDV täo ra bệnh tích khó quan sát bìng
kính hiển vi soi ngāČc Ċ các læn tiếp đĈi thçp.
Nhìm tëng tính chính xác, thay vì quan sát
bệnh tích tế bào, nghiên cău dùng kĐ thuêt hóa
miễn dðch trên tế bào 1 lĉp (IPMA) để xác đðnh
giếng có/khöng cò virus nhån lên và làm cën că
xác đðnh hiệu giá trung hòa (dĆa vào măc đû
giâm 90% sø tế bào/sø cĀm tế bào nhiễm virus
so vĉi đøi chăng âm).
Ghi chú: Huyết thanh âm chuèn (a-c) và huyết thanh dương chuèn (d-f) pha loãng tëng dæn từ 32, 64 và 128
læn. Tế bào nhiễm PEDV bít màu của cơ chçt (mũi tên). Độ pha loãng huyết thanh cao nhçt có khâ nëng ức chế
90% số tế bào nhiễm virus (so với đối chứng) được xác định là hiệu giá trung hòa (e).
Hình 1. Kết quâ đọc phân ứng trung hòa PEDV bằng phương pháp IPMA
479
Kết quả thiết lập phản ứng trung hòa Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV) sử dụng chủng thực địa phân lập tại
miền Bắc
Kết quâ Ċ hình 1 cho thçy cách đõc phân
ăng bìng phāćng pháp nhuûm IPMA phân biệt
rõ giąa méu không có kháng thể trung hòa (a-c)
và méu có kháng thể trung hña dāćng tính (d-
e). Ở méu huyết thanh âm chuèn, sø lāČng tế
bào nhiễm PEDV (mÿi tên) khöng cò sĆ khác
biệt đáng kể giąa các đû pha loãng. Ở méu
huyết thanh dāćng chuèn, theo chiều tëng cþa
đû pha loãng huyết thanh (tāćng ăng vĉi hàm
lāČng kháng thể trung hòa giâm dæn), sø lāČng
tế bào nhiễm virus (mÿi tên) tëng dæn.
Trong quá trình nhân lên cþa virus trong
möi trāĈng tế bào Vero, PEDV gây bệnh tích
ăng trung hña tāćng đøi nhó (30-300
TCID50/giếng) việc đõc kết quâ cþa phân ăng
thông qua bệnh tích tế bào gặp khò khën. Hæu
hết các tác giâ đõc phân ăng bìng cách nhuûm
3.3. Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của
phân ứng trung hòa
Đû nhäy và đû đặc hiệu cþa phân ăng
trung hòa mĉi đāČc thiết lêp và tøi āu đāČc
tính toán trên cć sĊ so sánh vĉi kết quâ cþa
phân ăng ELISA cć sĊ. Kết quâ biểu diễn møi
tāćng quan giąa hiệu giá trung hòa và giá trð
OD450 đāČc trình bày Ċ hình 2. Kết quâ cho
thçy Ċ mût hiệu giá trung hòa cø đðnh, giá trð
OD450 có khoâng biến đûng lĉn, ví dĀ giá trð
OD450 dao đûng tĂ 0,21-0,74 đøi vĉi nhóm g÷m
30 méu có hiệu giá trung hña là 6 log2 (mÿi
tên, Hình 2). Ở chiều ngāČc läi, phân ăng
trung hòa (liên quan tĉi khâ nëng bâo hû chøng
läi cöng cāĈng đûc) thể hiện āu điểm hćn so vĉi
phân ăng ELISA. Ví dĀ, phân ăng trung hòa
cho biết nhóm méu huyết thanh có giá trð
OD450 = 0,6 khöng cò tính đ÷ng nhçt về hiệu
giá trung hòa, biến đûng tĂ 5 log2 đến 9 log 2
(vüng đòng khung, Hình 2).
Ghi chú: Mỗi méu huyết thanh (biểu diễn bởi 1 chçm tròn) được xét nghiệm bìng phân ứng trung hòa và ELISA
để xác định hiệu giá trung hòa và giá trị OD450. Méu được đánh giá là có kháng thể trung hòa nếu có hiệu giá tối
thiểu là 5 log2 (giới hän bởi đường nét đứt).
Hình 2. Tương quan giữa hiệu giá trung hòa và giá trị OD
480
Nguyễn Thị Bích, Trần Văn Khánh, Nguyễn Thanh Ba, Chu Thị Thanh Hương
Bâng 3. Độ nhạy, độ đặc hiệu của phân ứng trung hòa
Kết quả ELISA
Kết quả trung hòa
Tổng hàng
Dương tính
Âm tính
Dương tính (≥ 5 log2)*
Âm tính (< 5 log2)
Tổng cột
125
18
1
126
72
54
55
143
198
Ghi chú: (*) méu huyết thanh ở độ pha loãng >1/20 làm giâm 90% số tế bào nhiễm PEDV
giâm so đối chứng åm được xác định là có kháng thể trung hòa (Clement và cs., 2016).
Trong nghiên cứu này lçy giá trị ngưỡng dương tính kháng thể trung hòa là ≥5 log2.
TĂ công thăc tính (Pearson Correlation
Coefficient Calculator), đã xác đðnh cò tāćng
quan tď lệ thuên giąa giá trð OD450 và hiệu giá
kháng thể trung hòa (giá trð Pearson's R = 0,61).
Kết quâ này là phù hČp vĉi mût sø nghiên cău
trāĉc đåy khi đều xác đðnh đāČc tāćng quan
giąa kết quâ phát hiện kháng thể kháng PEDV
bìng phân ăng trung hòa và phân ăng ELISA
nhāng tāćng quan kể trên chî Ċ măc trung bình.
Điều này đāČc giâi thích là do trong thành phæn
huyết thanh cþa lČn có nhiều lĉp khác thể trung
hòa PEDV (ví dĀ nhā IgG, IgA) nhāng phân ăng
ELISA dùng trong nghiên cău này chî phát hiện
các nghiên cău tiếp theo nhìm hoàn thiện phân
ăng trung hòa virus, cæn sĄ dĀng thêm các kĐ
thuêt phát hiện đāČc lĉp kháng thể đặc hiệu
IgG và IgA (hoặc sIgA tiết qua sąa), ví dĀ nhā
tính/dāćng tính vĉi kháng thể kháng PEDV
đāČc tóm tít Ċ bâng 3.
sø bìng ELISA). SĆ khác biệt trên có thể do mût
sø nguyên nhân. Thă nhçt, phân ăng trung hòa
phát hiện kháng thể làm mçt hoät tính nhiễm
cþa virus (kháng thể trung hña). Trong khi đò,
protein bề mặt cþa virus (ví dĀ nhā protein S)
läi bao g÷m các epitope kích thích sân sinh
kháng thể trung hòa và kháng thể không có khâ
ra, thĈi điểm xuçt hiện kháng thể trung hòa và
đät hiệu giá cao nhçt thāĈng chêm hćn so vĉi
kháng thể không có tác dĀng trung hòa virus
3.4. Kết quâ ứng dụng phân ứng trung hòa
với mẫu thực địa
Kết quâ ăng dĀng phân ăng trung hòa
trong khâo sát kháng thể cþa các cặp lČn nái -
lČn con (sau bú sąa đæu) Ċ mût sø trang träi
đāČc trình bày Ċ hình 3. Hình 3A cho biết phân
ăng trung hòa có thể phát hiện đāČc kháng thể
trung hòa Ċ 2 loäi méu khác nhau (huyết thanh
- sąa đæu). Trong cùng nhóm lČn, có thể thçy
kháng thể trong sąa non cao hćn hîn so kháng
thể trong huyết thanh mẹ (P <0,05). Đặc điểm
vĉi hàm lāČng IgG, IgM và IgA Ċ sąa đæu luôn
cao hćn tøi thiểu 2 læn so vĉi hàm lāČng trong
quâ theo nhóm lČn, dễ dàng thçy phân ăng
trung hòa mĉi thiết lêp còn phát hiện đāČc sĆ
biến đûng về hiệu giá kháng thể trung hòa Ċ múi
nhóm lČn (Hình 3B), đặc biệt là nhóm lČn con
theo mẹ vĉi khoâng biến đûng tĂ 5 log2- 10 log2.
Đåy cò thể do lČn nái cò hàm lāČng kháng thể
thçp và/hoặc măc tiếp nhên kháng thể truyền
qua sąa đæu khöng đ÷ng đều giąa các lČn con.
Bâng 3 cho biết phæn lĉn các méu (125/198
méu dāćng tính, 54/198 åm tính) đều có kết quâ
phát hiện giøng nhau giąa hai phāćng pháp.
DĆa vào công thăc tính, đû nhäy cþa phân ăng
trung hòa so vĉi phân ăng ELISA cć sĊ là
87,46% và đû đặc hiệu là 98,18%. SĆ không phù
hČp hoàn toàn giąa kết quâ cþa phân ăng trung
hòa và phân ăng ELISA đã đāČc chî ra Ċ mût
nghiên cău này: có 18 méu đāČc xác đðnh là âm
tính giâ (kết quâ phát hiện kháng thể trung hòa
so vĉi kết quâ phát hiện kháng thể lĉp IgG tùng
481
Kết quả thiết lập phản ứng trung hòa Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV) sử dụng chủng thực địa phân lập tại
miền Bắc
Ghi chú: Hiệu giá kháng thể trung hòa ở nhóm lợn nái và lợn con của chúng (A). Méu huyết thanh và
sữa đæu được lçy ở cùng nhóm lợn nái. Méu huyết thanh của lợn con thu thêp 2 ngày sau khi bú sữa
đæu (D2). Hiệu giá kháng thể trung hòa biểu diễn cho từng nhóm méu (B).
Hình 3. Biến động hiệu giá kháng thể trung hòa ở các nhóm mẫu
Nhā vêy, các kết quâ nêu trên đã chăng tó
phân ăng trung hña đāČc thiết lêp thành công.
Nghiên cău về huyết thanh hõc, nghiên cău trāĉc
đåy đã báo cáo, ăng dĀng phân ăng trung hòa
đánh giá khâ nëng kháng chéo giąa huyết thanh
kháng dòng mĉi nùi cò đûc lĆc thçp (S- INDEL)
vĉi virus đ÷ng chþng cao hćn hiệu giá kháng thể
trung hòa vĉi virus dð chþng dòng mĉi nùi cò đûc
lĆc cao (non- S INDEL) 4 læn, trong khi đò, giąa
huyết thanh kháng PEDV cþa dòng CV777 cù
điển vĉi virus đ÷ng chþng cao hćn hiệu giá kháng
thể trung hòa dð chþng (dòng mĉi nùi) 16 læn
(Chen & cs., 2016). Mặc dù vêy, cæn ăng dĀng
phân ăng trung hòa vĉi mût dung lāČng méu lĉn
hćn để tiếp tĀc đánh giá chçt lāČng cÿng nhā
hoàn thiện các điểm yếu có thể đāČc phát hiện
trong quá trình thĆc hiện.
4. KẾT LUẬN
Đã thiết lêp đāČc phân ăng trung hòa dùng
chþng PEDV thĆc đða vĉi đû nhäy 87,46% và đû
đặc hiệu là 98,18%. Phân ăng trung hña đã phát
hiện đāČc và phân ánh đýng đặc điểm hiệu giá
kháng thể trung hòa trong sąa đæu luön cao hćn
Ċ huyết thanh cþa lČn nái.
482
Nguyễn Thị Bích, Trần Văn Khánh, Nguyễn Thanh Ba, Chu Thị Thanh Hương
Lee C. (2015). Porcine epidemic diarrhea virus: An
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Bosch B.J., Van Der Zee R., De Haan C.A. & Rottier
P.J. (2003). The coronavirus spike protein is a
emerging and re-emerging epizootic swine virus,
Virol J. 12(1): 193.
Lee S. & Lee C. (2014). Outbreak-related porcine
epidemic diarrhea virus strains similar to US
strains, South Korea, 2013, Emerg Infect Dis.
20(7): 1223-6.
class
I
virus fusion protein: structural and
functional characterization of the fusion core
complex, Journal of virology. 77(16): 8801-8811.
Clement T., Singrey A., Lawson S., Okda F., Nelson J.,
Diel D., Nelson E.A. & Christopher-Hennings J.
(2016). Measurement of neutralizing antibodies
against porcine epidemic diarrhea virus in sow
serum, colostrum, and milk samples and in piglet
serum samples after feedback, Journal of Swine
Health and Production. 24(3): 147-153.
Lee S.H., Yang D.K., Kim H.H. & Cho I.S. (2018).
Efficacy of inactivated variant porcine epidemic
diarrhea virus vaccines in growing pigs, Clin Exp
Vaccine Res. 7(1): 61-69.
Nguyễn Thị Hoa, Nguyễn Thị Lan, Trương Quang
Lâm, Trịnh Đình Thâu & Ngô Thị Hạnh (2018).
Nghiên cứu phân lập và xác định một số đặc điểm
sinh học của virus PED (Porcine epidemic diarrhea
virus), Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam.
16(3): 257-267
Chen Q., Thomas J.T., Giménez-Lirola L.G., Hardham
J.M., Gao Q., Gerber P.F., Opriessnig T., Zheng Y.,
Li G. & Gauger P.C. (2016). Evaluation of
serological cross-reactivity and cross-neutralization
between the United States porcine epidemic diarrhea
virus prototype and S-INDEL-variant strains, BMC
veterinary research. 12(1): 70.
Nguyễn Trung Tiến, Vũ Thị Thu Hằng, Huỳnh Thị Mỹ
Lệ, Nguyễn Bá Hiên & Lê Văn Phan (2017). Một
số đặc điểm sinh học phân tử của virus gây ra dịch
tiêu chảy cấp ở lợn (porcine epidemic diarrhea-
PED) tại Quảng Trị, Thái Nguyên và Thái Bình từ
năm 2013-2014, Tạp chí Khoa học Nông nghiệp
Việt Nam. 13(7): 1089-1100.
Chung H.C., Nguyen V.G., Moon H.J., Lee J.H., Park
S.J., Lee G.E., Kim H.K., Noh Y.S., Lee C.H.,
Goede D. & Park B.K. (2015). Isolation of Porcine
Epidemic Diarrhea Virus during Outbreaks in
South Korea, 2013-2014, Emerg Infect Dis.
21(12): 2238-40.
Oh J.S., Song D.S., Yang J.S., Song J.Y., Moon H.J.,
Kim T.Y. & Park B.K. (2005). Comparison of an
enzyme-linked immunosorbent assay with serum
neutralization test for serodiagnosis of porcine
epidemic diarrhea virus infection, J Vet Sci.
6(4): 349-52.
De Arriba M., Carvajal A., Lanza I., Rubio P. &
Blanchard P. (1995). Development of an ELISA
for the detection of antibody isotypes against
porcine epidemic diarrhoea virus (PEDV) in sow’s
milk, Proc. 3rd Congr. ESVV. pp. 222-225.
Okda F., Liu X., Singrey A., Clement T., Nelson J.,
Christopher-Hennings J., Nelson E.A. & Lawson
S. (2015). Development of an indirect ELISA,
Collin E.A., Anbalagan S., Okda F., Batman R., Nelson
E. & Hause B.M. (2015). An inactivated vaccine
made from a US field isolate of porcine epidemic
disease virus is immunogenic in pigs as
demonstrated by a dose-titration, BMC veterinary
research. 11(1): 62.
blocking
ELISA,
fluorescent
microsphere
immunoassay and fluorescent focus neutralization
assay for serologic evaluation of exposure to North
American strains of Porcine Epidemic Diarrhea
Virus, BMC Vet Res. 11(1): 180.
Debouck P. & Pensaert M. (1980). Experimental
infection of pigs with a new porcine enteric
coronavirus, CV 777. Am J Vet Res. 41(2): 219-23.
Park B. & Song, D. (2016). Recent outbreaks and
emergence of mutants of porcine epidemic diarrhea
viruses (PEDV) in Korea, Japanese Journal of
Veterinary Research. 64(Supplement 1): S25-S32.
Kimpston-Burkgren K., Mora-Diaz J.C., Roby P.,
Bjustrom-Kraft J., Main R., Bosse R. & Gimenez-
Lirola L.G. (2020). Characterization of the
humoral immune response to porcine epidemic
diarrhea virus infection under experimental and
field conditions using an AlphaLISA platform,
Pathogens. 9(3).
Park J.E., Cruz D.J. & Shin H.J. (2011). Receptor-
bound porcine epidemic diarrhea virus spike
protein cleaved by trypsin induces membrane
fusion, Arch Virol. 156(10): 1749-56.
Paudel S., Park, J.E., Jang H., Hyun B.H., Yang D.G.
& Shin H.J. (2014a). Evaluation of antibody
response of killed and live vaccines against porcine
epidemic diarrhea virus in a field study, Vet Q.
34(4): 194-200.
Hao J., Zhang Y., Fang S., Wen Z., Zhang X., Xue C.
&
Cao Y. (2017). Evaluation of purified
recombinant spike fragments for assessment of the
presence of serum neutralizing antibodies against a
variant strain of porcine epidemic diarrhea virus,
Virol Sin. 32(4): 307-316.
Paudel S., Park J.E., Jang H. & Shin H.J. (2014b).
Comparison of serum neutralization and enzyme-
linked immunosorbent assay on sera from porcine
epidemic diarrhea virus vaccinated pigs, Vet Q.
34(4): 218-23.
Hofmann M. & Wyler R. (1988). Propagation of the
virus of porcine epidemic diarrhea in cell culture, J
Clin Microbiol. 26(11): 2235-9.
483
Kết quả thiết lập phản ứng trung hòa Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV) sử dụng chủng thực địa phân lập tại
miền Bắc
Pensaert M.
&
De Bouck P. (1978).
A
new
of porcine epidemic diarrhea virus in the United
States: clinical signs, lesions, and viral genomic
sequences. Journal of veterinary diagnostic
investigation. 25(5): 649-654.
coronavirus-like particle associated with diarrhea
in swine, Archives of virology. 58(3): 243-247.
Porter P. (1969). Transfer of immunoglobulins IgG,
IgA and IgM to lacteal secretions in the parturient
sow and their absorption by the neonatal piglet,
Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein
Structure. 181(2): 381-392.
Sun R.Q., Cai R.J., Chen Y.Q., Liang P.S., Chen D.K.
& Song C.X. (2012). Outbreak of porcine epidemic
diarrhea in suckling piglets, China. Emerg Infect
Dis. 18(1): 161-3.
Shin H.J. & Park J.E. (2019). Newly isolated porcine
epidemic diarrhea virus resistance to interferon and
neutralizing antibody, The Journal of Immunology.
202(1 Supplement): 73.12.
Toan N.T., Puranaveja S. & Thanawongnuwech R.
(2011). Genetic characterization of porcine
epidemic diarrhea virus (PEDV) isolates from
southern Vietnam during 2009-2010 outbreaks,
The Thai Journal of Veterinary Medicine.
41(1): 55-64.
Song D. & Park B. (2012). Porcine epidemic diarrhoea
virus: a comprehensive review of molecular
epidemiology, diagnosis, and vaccines. Virus
Genes. 44(2): 167-75.
Thomas J.T., Chen Q., Gauger P.C., Gimenez-Lirola
L.G., Sinha A., Harmon K.M., Madson D.M.,
Burrough E.R., Magstadt D.R., Salzbrenner H.M.,
Welch M.W., Yoon K.J., Zimmerman J.J. & Zhang
J. (2015). Effect of porcine epidemic diarrhea virus
infectious doses on infection outcomes in naive
conventional neonatal and weaned pigs. PLoS One.
10(10): e0139266.
Song D.S., Kang B.K., Oh J.S., Ha G.W., Yang J.S.,
Moon H.J., Jang Y.S. & Park B.K. (2006).
Multiplex reverse transcription-PCR for rapid
differential detection of porcine epidemic diarrhea
virus, transmissible gastroenteritis virus, and
porcine group A rotavirus. J. Vet Diagn Invest.
18(3): 278-81.
Wang L., Byrum B. & Zhang Y. (2014). New variant
of porcine epidemic diarrhea virus, United States.
Emerg Infect Dis. 20(5): 917-9.
Song Q., Stone S., Drebes D., Greiner L.L., Dvorak
C.M.T. & Murtaugh M.P. (2016). Characterization
of
anti-porcine
epidemic
diarrhea
virus
Zhao P.D., Bai J., Jiang P., Tang T.S., Li Y., Tan C. &
Shi X. (2014). Development of a multiplex
TaqMan probe-based real-time PCR for
discrimination of variant and classical porcine
epidemic diarrhea virus. J. Virol Methods.
206: 150-5.
neutralizing activity in mammary secretions. Virus
Res. 226: 85-92.
Stevenson G.W., Hoang H., Schwartz K.J., Burrough
E.R., Sun D., Madson D., Cooper V.L., Pillatzki
A., Gauger P. & Schmitt B.J. (2013). Emergence
484
10 trang
09/01/2024
20940
Free
Bạn đang xem tài liệu "Kết quả thiết lập phản ứng trung hòa Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) sử dụng chủng thực địa phân lập tại miền Bắc", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên
File đính kèm:
- ket_qua_thiet_lap_phan_ung_trung_hoa_porcine_epidemic_diarrh.pdf
