Nghiên cứu tinh sạch thể vùi Nucleo polyhedrosis virus (NPV) sâu khoang và tạo dạng chế phẩm
12 Lê T. H. Hà và Lê V. Trịnh. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 14(2), 12-20
NGHIÊN CỨU TINH SẠCH THỂ VÙI NUCLEO POLYHEDROSIS
VIRUS (NPV) SÂU KHOANG VÀ TẠO DẠNG CHẾ PHẨM
LÊ THANH HẢI HÀ1,*, LÊ VĂN TRỊNH2
1Trường Đại học Bách khoa, Hà Nội
2Viện Bảo vệ thực vật
*Email: lethanhhaiha.aw@gmail.com
(Ngày nhận: 13/02/2019; Ngày nhận lại: 26/03/2019; Ngày duyệt đăng: 10/04/2019)
TÓM TẮT
Hiệu lực phòng trừ sâu hại cây trồng của một chế phẩm virus tùy thuộc rất lớn vào hàm lượng
thể vùi của NPV có trong chế phẩm và đảm bảo phải đạt từ 9,0 x 1011 đến 3,0 x 1012 OB/ha sau khi
phun rải trên đồng ruộng. Vì vậy, việc tinh sạch và định lượng thể vùi khi tạo dạng sử dụng sản phẩm
là yêu cầu cần thiết. Kết quả nghiên cứu trong năm 2017 đã xác định có thể tinh sạch để thu hoạch
thể vùi tinh của virut NPV sâu khoang (Spodoptera litura Fabricius) bằng việc phối hợp sử dụng
2 lần SDS xen kẽ với 3 lần nước cất thì lượng thể vùi thu được cao nhất, đạt tới 2,35 x 1010 OB/ml
và tỷ lệ thu hồi thể vùi tới 83,93%. Khi tạo dạng sử dụng chế phẩm với liều lượng 500 gam/ha
dưới dạng bột thấm nước có hàm lượng thể vùi 2,0 x 109 OB/gam, tương đương 1 x 1012 OB/ha
cho hiệu quả gây chết sâu khoang trong điều kiện phòng thí nghiệm đạt 81,23% với chế phẩm
không bổ sung Boric và đạt 87,14% với chế phẩm có bổ sung thêm 5% axit Boric, đạt tới 81,13
% và 82,92% (tương ứng) trong điều kiện nhà lưới ở thời điểm 7 ngày sau phun.
Từ khóa: Bột thấm nước; NPV (Nucleo Polyhedrosis Virus); OB (Oclussion Bodies); Sâu
khoang (Spodoptera litura); Thể vùi tinh.
Occlusion bodies purity of Nuclear Polyhedrosis Virus and product formulation
ABSTRACT
The efficacy in controling to insect pest in crop of a virus biopesticide was significant depends
on the concentration of occlusion bodies (OB) of NPV and dosage of product released in crop field
after spraying which how to meet level from 9,0 x 1011 to 3,0 x 1012 OBs per hecta. By that, it is
considered to be nescesary in OBs purity and qualification when making using formulation.
The result of a study undertaken in 2017 showed that the OBs of Spodoptera litura NPV could
be purified by rotational use of two times of SDS and three times of pure water. By the way, the
quantity of NPV‘s OB could be to 2,35 x 1010 OB/ml and their harvested percentage reached to
83.93%. The result of study was also showed that it was possible to formulate bioproduct under
the wettable powder for a hectare with dosage of 500 gram, in which the concentration of 2,0 x 109
OBs per gram equivalence an using dosage of 1 x 1012 Obs per ha of crop. It was also indicated that
the efficacy in controlling to the insect pest reached to 81.23% with product without adding 5%
Boric axit and 87,14% for the product mixtured with 5% of Boric axit in laboratory experiment,
to 81,13% and 82.92% (equivalent) in greenhouse condition at 7 days after spraying.
Keywords: NPV (Nucleo Polyhedrosis Virus); OB (Occlusion Bodies); Pured Obs;
Spodoptera litura insect pest; Wettable powder.
Lê T. H. Hà và Lê V. Trịnh. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 14(2), 12-20 13
1. Đặt vấn đề
2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1. Vật liệu
Sâu khoang (Spodoptera litura) là sâu hại
quan trọng trên nhiều loại cây trồng khác nhau
và chế phẩm NPV (Nucleo Polyhedrosis Virus)
thường có hiệu quả cao trong phòng trừ sâu hại
này. Tuy nhiên, hàm lượng thể vùi của vi rút
NPV (Nucleo Polyhedrosis Virus) trong chế
phẩm là yếu tố quyết định hiệu lực trừ sâu. Lâu
nay, việc sản xuất NPV vẫn tiến hành theo
phương pháp thủ công bằng cách nuôi sâu sống
số lượng lớn, sau đó nhiễm vi rút NPV của loài
sâu tương ứng, rồi nghiền lọc và đem ra sử
dụng (Nguyễn Văn Cảm và cộng sự, 1996).
Với cách làm này, chất lượng sản phẩm khi sử
dụng không ổn định do không thể kiểm soát
được số lượng thể vùi có trong sản phẩm. Vì
vậy, việc tinh sạch để thu hoạch thể vùi tinh để
định lượng trước khi tạo dạng sử dụng chế
phẩm là khâu kỹ thuật không thể thiếu trong
quá trình sản xuất chế phẩm NPV phục vụ
phòng trừ sâu hại cây trồng nông nghiệp.
Kết quả nghiên cứu của các tác giả
Cisneros và cộng sự (2002) đã chỉ rõ lượng sử
dụng chế phẩm NPV phải tính theo tổng lượng
thể vùi cần phun cho 1 ha cây trồng để phòng
trừ sâu hại và tùy theo từng đối tượng sâu hại
khác nhau, đối với sâu khoang và sâu keo da
láng cần đảm bảo tới 9,0 x 1011 OB/ha, còn đối
với sâu xanh phải từ 1,5- 3,0 x 1012 OB/ha tùy
theo từng loại cây trồng có tán lá rộng hay hẹp.
Như vậy, việc tạo dạng sản phẩm để sử dụng
phòng trừ loài sâu hại chủ đích có thể có những
khác nhau, nhưng nhiều tác giả đều khẳng định
liều lượng sản phẩm sử dụng có thể nhiều hay
ít tùy theo công nghệ tạo dạng, nhưng cần phải
đảm bảo được số lượng thể vùi phun rải đối với
từng loài sâu hại cụ thể. Điều đó đòi hỏi thể vùi
phải được định lượng một cách chủ động trước
khi tạo dạng. Có như vậy mới có thể đảm bảo
chế phẩm có chất lượng ổn định và hiệu quả
cao trong phòng trừ sâu hại khi sử dụng trên
đồng ruộng.
Bao gồm sâu khoang được nuôi nhân bằng
thức ăn nhân tạo và NPV được nhân sinh khối
trên tế bào sâu khoang. Hoá chất SDS phục vụ
tinh sạch thể vùi và phân tích PCR. Các phụ gia
tạo bột thấm nước như bột tan, khoáng sét và
axit Boric.
Các nội dung nghiên cứu được thực hiện
năm 2017 tại phòng thí nghiệm và nhà lưới của
Trung tâm Sinh học (Viện Bảo vệ thực vật –
Bộ Nông nghiệp và PTNT).
2.2. Tinh sạch thể vùi tinh
Tiến hành theo phương pháp của Sajap và
cộng sự (2000). Thí nghiệm với 7 công thức tinh
sạch thể vùi khác nhau với dịch thể vùi vi rút
NPV thu hoạch vào thời điểm 10 ngày sau khi
nhiễm trên tế bào nhân nuôi được xác định là
2,8 x 108 OB/ml. Tiến hành ly tâm với tốc độ
1.500 vòng/phút trong 5 phút để loại bỏ dịch
môi trường. Các lần tiếp theo được tiến hành sau
khi pha loãng với 100ml nước cất vô trùng hoặc
với 100ml dung dịch SDS 0,1%, sau đó tiến
hành ly tâm với tốc độ 1.500 vòng/phút trong 5
phút và gạn bỏ phần dịch lỏng, giữ lại phần thể
vùi tinh màu trắng đục đã được làm sạch.
2.3. Kiểm định NPV sâu khoang
Phân tích giải trình tự gen theo phương
pháp PCR và so sánh với ngân hàng Genbank.
Các gen để kiểm định gồm 3 gen có mức độ
bảo thủ cao trong số các NPVs được sử dụng
để làm DNA khuôn cho phản ứng PCR, gồm:
Polyhedrin (Polh); Granulin (gran) và Late
expression factor gene (lef-8, lef-9). Hệ thống
PCR dùng khuếch đại gen là Eppendorf
Mastercycler Pro- S.
Sản phẩm PCR được phân ly bằng 1%
Agarose gel và được tinh sạch từ Agarose gel
sử dụng DNA Purification Kit (Qiagen). Sau
đó, sản phẩm PCR tinh sạch được gắn vào
pDrive cloning vector sử dụng pDrive Cloning
kit (Qiagen) rồi đọc trình tự bằng máy
ABI3100 sử dụng BigDye Terminator 3.1 Kit
(Applied Biotech). Trình tự các mẫu được so
sánh mức độ tương đồng với nhau bằng phần
Dưới đây xin trình bày kết quả nghiên cứu
phân lập tinh sạch thể vùi tinh NPV sâu khoang
và tạo dạng sử dụng chế phẩm.
14 Lê T. H. Hà và Lê V. Trịnh. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 14(2), 12-20
mềm ClustalW2 và so sánh với Ngân hàng Gen
bằng phần mềm BLAST. Cây phả hệ được xây
dựng theo phương pháp Neighbor-joining
trong phần mềm MEGA 6.0.
Theo dõi số sâu sống, sâu chết ở các công
thức thí nghiệm và tính hiệu lực gây chết sâu
khoang của chế phẩm theo công thức Abbott:
C – T
H(%) = ------------ x 100
2.4. Tạo dạng sử dụng chế phẩm
Tiến hành theo phương pháp tạo dạng bột
thấm nước với phụ gia gồm 60% bột tan và
40% bột khoáng sét. Các phụ gia được nghiền
nhỏ mịn với kích thước 0,02- 0,05mm.
Trước hết, đếm số lượng thể vùi tinh và
tính toán số lượng thể vùi trong chế phẩm tạo
dạng đảm bảo hàm lượng 2 x 109 OB/gam với
định hướng liều lượng 500 gam/ha sẽ có được
lượng thể vùi phun rải cho 1 ha cây trồng là 1
x 1012 OB/ha. Đếm số lượng thể vùi tinh theo
phương pháp pha loãng và nhuộm màu bằng
Tryphan Blue. Sau đó kiểm tra số thể vùi trên
buồng đếm hồng cầu dưới kính hiển vi, từ đó
xác định lượng thể vùi cần sử dụng để phối trộn
với phụ gia để tạo ra 1kg chế phẩm. Nếu tạo
chế phẩm có chứa axit Boric, pha 50 gam axit
với 100ml nước cất rồi phun trộn đều cho 1kg
chế phẩm.
Điều chỉnh mức pH của chế phẩm từ 6,5 -
7,0 và sấy khô ở nhiệt độ 30 - 350C trong thời
gian 10 - 12 giờ để độ ẩm ở mức 10 - 12%. Sau
đó, đóng gói trong bao giấy bạc và bảo quản
chế phẩm ở nhiệt độ thường hoặc nhiệt độ từ 5
đến 100C trong khi chờ sử dụng.
2.5. Đánh giá hiệu quả trừ sâu khoang
của chế phẩm trong phòng thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí trong phòng thí
nghiệm bằng cách phun chế phẩm lên sâu non
tuổi 2 được nuôi trên lá bắp cải trong bô can
thuỷ tinh đường kính 20cm với 3 công thức, 3
lần nhắc lại/công thức, mỗi lần nhắc lại là một
bô can có 50 sâu non sâu khoang, tương ứng
với các công thức như sau:
C
Trong đó: C là số sâu sống ở công thức đối
chứng
T là số sâu sống ở công thức thí
nghiệm
2.6. Đánh giá hiệu lực phòng trừ sâu
khoang của chế phẩm ngoài nhà lưới
Thí nghiệm được tiến hành trên sâu
khoang hại rau bắp cải được trồng trong nhà
lưới. Thí nghiệm được bố trí với 5 công thức,
3 lần nhắc lại/công thức. Mỗi lần nhắc lại tiến
hành trên 10 cây bắp cải 50 ngày tuổi được thả
5 sâu tuổi 2 cho mỗi cây.
Công thức 1: Chế phẩm NPV-1 không có
axit Boric, liều lượng 500gam/ha, nồng độ
phun 0,1%.
Công thức 2: Chế phẩm NPV-1 không có
axit Boric, liều lượng 500gam/ha, nồng độ
phun 0,1%.
Công thức 3: Sâu chết bệnh được nghiền, lọc
với liều lượng 500 sâu/ha và nồng độ phun 5%
Công thức 4: Đối chứng, phun nước lã.
Theo dõi mật độ sâu khoang sống trước
phun, sau phun 7 ngày và tính hiệu lực phòng
trừ sâu khoang của chế phẩm theo công thức
Henderson – Tilton:
Ta x Cb
H (%) = (1 - ----------- ) x 100
Tb x Ca
Trong đó: Ta là số sâu sống ở công thức
thí nghiệm sau xử lý
Tb là số sâu sống ở công thức
thí nghiệm trước xử lý
Công thức 1: Chế phẩm NPV-1 không có
axit Boric, liều lượng 500gam/ha, nồng độ
phun 0,1%.
Công thức 2: Chế phẩm NPV-1 không có
axit Boric, liều lượng 500gam/ha, nồng độ
phun 0,1%.
Ca là số sâu sống ở công thức
đối chứng sau xử lý
Cb là số sâu sống ở công thức
đối chứng trước xử lý
2.7. Phương pháp tính toán, xử lý số liệu
Xử lý thống kê số liệu theo chương trình
Irristat 4.0 trên phần mềm Excel.
Công thức 3: Đối chứng phun nước lã.
Lê T. H. Hà và Lê V. Trịnh. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 14(2), 12-20 15
lần SDS 0,1% ly tâm trong thời gian 5 phút/lần
để phân lập thì hàm lượng thể vùi tinh thu được
đạt từ 2,33 x 108 OB/ml (thu được 83,21%
lượng thể vùi trước tinh sạch). Nếu ly tâm trong
thời gian 3 phút/lần trong việc dùng 2 lần nước
cất xen kẽ với 1 lần SDS thì lượng thể vùi thu
được là cao nhất, tới 2,71 x 108 OB/ml, bằng
96,79% lượng thể vùi. Nếu sử dụng 2 lần SDS
0,1% xen kẽ với 2 lần nước cất vô trùng thì hàm
lượng thể vùi có thể đạt từ 2,10 x 1010 OB/ml,
còn sử dụng 2 lần SDS xen kẽ với 3 lần nước
cất thì lượng thể vùi thu được là 2,35 x 1010
OB/ml. Lượng thể vùi thu được tương ứng là
75,0% và 83,93% (Bảng 1).
3. Kết quả nghiên cứu
3.1. Tinh sạch thể vùi
Kết quả thí nghiệm với 7 công thức tinh
sạch thể vùi khác nhau với dịch thể vùi vi rút
NPV thu hoạch sau khi nhiễm trên tế bào nhân
nuôi được xác định là 2,8 x 108 OB/ml ở thời
điểm 10 ngày sau khi nhiễm được trình bày ở
Bảng 1. Kết quả cho thấy khi phân lập, tinh sạch
thể vùi nếu sử dụng từ 2 – 4 lần nước cất vô
trùng thì hàm lượng thể vùi tinh thu được từ 1,04
- 1,80 x 108 OB/ml. Điều đó có nghĩa lượng thể
vùi bị loại bỏ đi khá nhiều, chỉ thu được 37, 14-
64,26% số thể vùi có được sau khi nhiễm.
Nếu sử dụng 1 lần nước cất vô trùng với 1
Bảng 1
Hàm lượng thể vùi tinh thu được sau khi nhiễm trên tế bào với các phương pháp tinh sạch khác nhau
Công thức
thí nghiệm
Phương pháp
Hàm lượng
phân lập tinh sạch thể vùi tinh
thể vùi (OB/ml)
Công thức 1
Công thức 2
Công thức 3
Công thức 4
Công thức 5
Công thức 6
Công thức 7
2 lần (nước cất)
1,04 x 108
1,50 x 108
1,80 x 108
2,33 x 108
2,71 x 108
2,10 x 1010
2,35 x 1010
3 lần (nước cất)
4 lần (nước cất)
2 lần (nước cất - SDS)
3 lần (nước cất- SDS - nước cất)
4 lần (SDS - nước cất- SDS - nước cất)
5 lần (nước cất- SDS - nước cất- SDS - nước cất)
Có thể sử dụng nước để tinh sạch thu hồi
tinh sẽ ít hơn. Đồng thời, việc phân lập thành
công thể vùi tinh đã tạo ra việc tạo dạng chế
phẩm vi rút sẽ đơn giản hơn nhiều. Vì từ dịch
thể tế bào nuôi nhân sau khi nhiễm vi rút NPV
(sản xuất theo công nghệ tế bào) hoặc từ dịch
nghiền sâu non chết sau khi nhiễm NPV (sản
xuất theo công nghệ truyền thống), sau khi
phân lập thể vùi tinh sẽ cho phép dễ dàng trong
bảo quản nguyên liệu thể vùi và tạo dạng sử
dụng chế phẩm khác nhau với hàm lượng thể
vùi như đã được dự kiến cho 1 ha cây trồng cần
phòng trừ sâu khoang. Đặc biệt đối với tạo
dạng bột thấm nước với hàm lượng thể vùi
trong chế phẩm một cách mong muốn.
thể vùi tinh tạo ra sau khi nhiễm tế bào bằng
nước cất khi ly tâm với tốc độ 600 vòng/phút
là chưa đáp ứng yêu cầu của việc làm sạch và
giữ được tối đa thể vùi tinh. Còn cách làm của
Kanokwan và cộng sự (2004) đã thực hiện tinh
sạch thể vùi tinh bằng cách ly tâm với tốc độ
5.000 vòng/phút để loại bỏ môi trường nuôi
nhân, sau đó ly tâm lại bằng nước cất có thể có
hiệu quả hơn.
Với lượng thể vùi thu được rất dễ dàng cho
việc tạo sản phẩm dạng bột thấm nước, dịch
lỏng hoặc để đông khô phục vụ bảo quản lâu
dài vì thể tích để bảo quản nguyên liệu thể vùi
16 Lê T. H. Hà và Lê V. Trịnh. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 14(2), 12-20
M
3
1
2
4
5
6
510 bp
M: Marker, 100 bp, Fermentas; 1: H2O (negative control);
Mẫu 2- 5: NPV trên tế bào; Mẫu 6: NPV của sâ u non bị bệnh
Hình 1. Kết quả phân tích PCR các mẫu NPV trên tế bào và sâu bị bệnh
Qua tiến hành phân tích cấu trúc trình
tự gen của sản phẩm nhân sinh khối NPV từ
tế bào trên cơ sở áp dụng kỹ thuật PCR. Kết
quả gửi phân tích giải xây dựng cây phả
hệ của cả 4 mẫu vi rút NPV sâu khoang
(Spodoptera litura) thu được sau lây nhiễm
trên tế bào và trên sâu non đã xác định
trình tự gen của chúng hoàn toàn giống nhau
(Hình 1) và đều thuộc loài Spodoptera litura
Nucleo Polyhedrosis Virus (NPV-Spl), giống
Alphabaculovirus, họ Baculoviridae với độ
tương đồng 100% khi so sánh trình tự gen
NPV trên ngân hàng GenBank và cùng nhánh
với trình tự gen của vi rút NPV sâu khoang
của Ấn Độ (Bảng 2 và Hình 2). Kết quả phân
tích cho phép khẳng định sản phẩm vi rút
NPV được sản xuất bằng công nghệ lây nhiễm
trên tế bào nhân nuôi.
Bảng 2
Các chủng NPV sâu khoang sử dụng trong phân tích phả hệ
Nguồn vi rút
Tên mẫu phân tích 1. Mã số enBank Nguồn gốc
Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus
polyhedrin gene
Từ NPVSpl-2
đến NPVSpl-5
Việt Nam
-
-
Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus
polyhedrin gene
Việt Nam
NPVSpl-6
Spodotera litura nuclear polyhydrosis virus
polh gene for polyhedrin
X94437
Ấn Độ
SpltNPV-In
SpltNPV-Jap
SpltNPV-Kore
Spodoptera litura NPV gene for polyhedron
AB326102
DQ152923
Nhật Bản
Hàn Quốc
Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus
polyhedrin gene
Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus
polyhedrin gene
DQ350142
AY706714
Hàn Quốc
Đức
SpltNPV-Kore
SpltNPV-Ger
Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus
polyhedrin gene
Lê T. H. Hà và Lê V. Trịnh. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 14(2), 12-20 17
Nguồn vi rút
Tên mẫu phân tích 1. Mã số enBank Nguồn gốc
Spodoptera litura nucleopolyhedrovirus
polyhedrin gene
AY706715
AF068189
D01017
Đức
SpltNPV- Ger
SpltNPV-Aus
Spodoptera litura nuclear polyhedrosis virus
polyhedrin (polh) gene
Australia
Pháp
-
Spodoptera littoralis NPV gene for nuclear
polyhedron
SpltNPV- Fra
PiraGV
Pieris rapae granloviruses
AY706673
SpltNPV -Jap ( AB326102)
SpltNPV -Ger ( AY706715)
SpltNPV -Ger ( AY706714)
SpltNPV -Aus (AF068189)
95
100
100
SpltNPV - Kore (DQ152923)
99 SpltNPV -Kore (DQ350142)
SpltNPV -Fra (D01017)
SpltNPV -In (X94437)
100
SpltNPV
2- 5
-
100
SpltNPV -
6
PiraGV (AY706673)
0.05
Hình 2. Cây phả hệ xây dựng theo phương pháp Neighbor-joining
Ghi chú: So sánh trình tự gen polh với các đại diện từ Ngân hàng Gen. Mẫu vi rút NPV sâu khoang của Việt Nam
được in đậm (mũi tên). Tên mẫu phân tích được chỉ rõ ở Bảng 1, mã số Ngân hàng Gen đặt trong dấu ngoặc đơn.
Sâu Pieris rapae granuloviruses được đưa vào làm đối chứng. Gốc nhánh là giá trị thống kê Bootstrap với 1000
lần lặp (chỉ ghi những giá trị lớn hơn 80%). Thước đo khoảng cách di truyền 5%.
lượng thể vùi là 2,0 x 109 OB/gam với ý tưởng
3.2. Nghiên cứu tạo chế phẩm NPV dạng
sử dụng theo liều lượng 500 gam/ha. Trong đó
NPV-1là chế phẩm không có axit Boric và
NPV-2 là chế phẩm có bổ sung thêm 0,5% axit
Boric để phục vụ các thí nghiệm đánh giá hiệu
quả phòng trừ sâu khoang của chế phẩm.
Đánh giá hiệu lực gây chết sâu khoang của
các chế phẩm trong điều kiện phòng thí nghiệm
với các liều lượng và nồng độ phun khác nhau
được tính toán dựa trên số lượng thể vùi của vi
rút NPV có trong sản phẩm và số lượng
cần thiết cho 1 ha như khi sử dụng ngoài
đồng ruộng.
bột thấm nước
Dù tạo dạng sử dụng theo cách nào và định
hướng liều lượng sử dụng chế phẩm là bao
nhiêu thì mục tiêu cuối cùng vẫn phải đảm bảo
tổng lượng thể vùi phun rải cho 1 ha cây trồng
đạt từ 9 x 1010 đến 1 x 1012 OB/ha (Grzywacz
và cộng sự, 1996). Theo Cisneros và cộng sự
(2002) thì việc bổ sung axit Boric sẽ góp phần
duy trì độ pH trong chế phẩm ở mức trung tính
để thể vùi không bị công phá và giúp bảo vệ
thể vùi không bị diệt khi bị tác động của ánh
sáng cực tím.
Kết quả đã tiến hành tạo dạng thử nghiệm
được 2 loại sản phẩm bột thấm nước có hàm
Kết quả thí nghiệm (Bảng 3) hiệu lực
phòng trừ sâu khoang của chế phẩm NPV-1 có
18 Lê T. H. Hà và Lê V. Trịnh. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 14(2), 12-20
hàm lượng 2,0 x 109 OB/gam đạt 81,23%. Khi
có bổ sung thêm 0,5% axít Boric với liều lượng
5gam/kg chế phẩm (NPV-2) khi tạo dạng thì
hiệu lực trừ sâu đạt tới 87,14%, cao hơn so với
không bổ sung axít Boric.
trên rau bắp cải của chế phẩm trong nhà lưới
(Bảng 4) cho thấy: Khi sử dụng chế phẩm dạng
bột thấm nước NPV-1 có hàm lượng 2,0 x 109
OB/gam và sử dụng với liều lượng 500 gam/ha
(tương đương với 1,0 x 1012 OB/ha) hiệu quả
đạt 81,13% ở 7 NSP chế phẩm.
Kết quả đánh giá hiệu lực trừ sâu khoang
Bảng 3
Hiệu lực phòng trừ sâu khoang của các dạng sản phẩm trong điều kiện phòng thí nghiệm
Công thức
thí nghiệm
Loại
Liều lượng cho 1
Nồng độ
Hiệu lực
ha (gam)
sản phẩm
sử dụng (%)
trừ sâu (%)
1
2
3
NPV-1
NPV-2
500 gam
500 gam
Nước lã
0,1
0,1
-
81,23
87,14
-
Đối chứng
Ghi chú: NPV-1: chế phẩm không bổ sung axit Boric;
NPV-2 : chế phẩm có bổ sung thêm 0,5% axit Boric
Nếu sử dụng chế phẩm có bổ sung thêm
0,5% axit Boric (NPV-2) với liều lượng
5gam/kg chế phẩm thì hiệu lực trừ sâu khoang
đạt 82,92%, cao hơn chế phẩm không bổ sung
Boric là 1,79%. Tuy nhiên, kết quả xử lý thống
kê cho thấy không có sự sai khác có ý nghĩa về
hiệu quả phòng trừ sâu khoang giữa 2 công
thức chế phẩm.
Trong khi đó, nếu sử dụng sâu chết bệnh
do NPV theo phương pháp truyền thống với
liều lượng sử dụng là 500 sâu chết bệnh cho
1ha và phun với nồng độ 5% thì hiệu lực trừ
sâu cũng chỉ đạt 47,68% (Bảng 4). Kết quả này
hoàn toàn phù hợp với kết quả thí nghiệm trước
đây của tác giả Nguyễn Văn Cảm và cộng sự
(1996).
Bảng 4
Hiệu lực phòng trừ sâu khoang trên rau bắp cải của chế phẩm trong điều kiện nhà lưới
Công
thức
Lượng sử dụng Nồng độ phun Hiệu lực ở 7NSP
Loại chế phẩm
1 ha
(%)
0,1
0,1
5,0
-
(%)
81,13 a
82,92 a
47,68 b
-
CT 1 NPV-1
CT 2 NPV-2
500 gam
500 gam
CT 3 Sâu bị bệnh nghiền lọc (Đ/c 1)
500 sâu
CT 4 Nước lã (Đ/c 2)
-
-
-
CV (%)
LSD
-
0,437
5,18
-
Ghi chú: Đ/c: Đối chứng; NSP: Ngày sau phun
NPV-1: chế phẩm không bổ sung axit Boric;
NPV-2 : chế phẩm có bổ sung thêm 0,5% axit Boric
Lê T. H. Hà và Lê V. Trịnh. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 14(2), 12-20 19
thể vùi tách rời nhau, dễ phân bố đồng đều
trong phụ gia khi tạo dạng sản phẩm.
4. Thảo luận
Nhận thức rõ việc xác định được kỹ thuật
phân lập thể vùi tinh là khâu kỹ thuật hết sức
quan trọng và có tính thực tiễn cao trong chuỗi
các công đoạn của quá trình sản xuất chế phẩm
vi rút. Dựa theo phương pháp Shapiro và
Shepard (2007). Sajap và cộng sự (2000) để thu
hoạch thể vùi tinh từ dịch tế bào đã nhiễm vi
rút NPV bằng cách li tâm 1500 vòng/phút sử
dụng nước cất kết hợp sử dụng SDS 0,1%, mỗi
lần ly tâm với nước cất hoặc SDS trong thời
gian 5 phút. Kết quả thí nghiệm cho thấy việc
tinh sạch thể vùi tinh giúp cho việc bảo quản
thuận tiện, không cần nhiều dụng cụ và thiết bị.
Đồng thời, sản phẩm thể vùi tinh sau tinh sạch
giúp chủ động định lượng số lượng thể vùi cần
thiết khi tạo dạng sử dụng sản phẩm. Đồng
thời, việc thu hoạch thể vùi tinh còn tạo điều
kiện bảo quản lâu dài dễ dàng và vận chuyển
với khối lượng ít khi đi xa, đến nơi tiêu thụ sản
phẩm mới tiến hành tạo dạng mà chưa cần phải
tạo dạng sử dụng sản phẩm ngay.
Theo Huda và cộng sự (2012) thì SDS
(Sodium Dodecyl Sulphate) là một tác nhân tạo
sủi trong việc phân lập thể vùi tinh từ dịch tế
bào đã nhiễm vi rút NPV vì SDS có tác dụng
giúp cân bằng sinh lý tế bào, không gây phá vỡ
vỏ protein của thể vùi và chống hiện tượng kết
mảng thể vùi sau khi phân lập thể vùi tinh.
Sajap và cộng sự (2000), Grzywacz và cộng sự
(1996) cho rằng sử dụng SDS (Sodium
Dodecyl Sulfate) để thu hoạch thể vùi tinh từ
dịch nhiễm có hiệu quả cao do chúng làm cho
Nghiên cứu của Shapiro và Shepard
(2007) đã khẳng định việc bổ sung axit Boric
với tỷ lệ 0,5% có tác dụng giúp thể vùi NPV
bền vững dưới tác động của tia tử ngoại. Kết
quả thử nghiệm cho thấy hoàn toàn có thể tạo
dạng sử dụng chế phẩm với liều lượng 500
gam/ha dưới dạng bột thấm nước có hàm lượng
thể vùi 2,0 x 109 OB/gam, tương đương 1 x 1012
OB/ha với phụ gia có thành phần gồm 60% bột
tan và 40% cao lanh. Cách làm này ưu việt hơn
so với cách làm truyền thống vì nhu cầu lượng
phụ gia cho tạo dạng ít hơn, thuận tiện cho việc
bảo quản, vận chuyển tiêu thụ sản phẩm và tiện
dùng cho người nông dân khi sử dụng để phòng
trừ sâu khoang hại cây trồng nông nghiệp.
5. Kết luận
Có thể tinh sạch để thu hoạch thể vùi tinh
NPV sâu khoang bằng việc phối hợp sử dụng
2 lần SDS xen kẽ với 3 lần nước cất thì lượng
thể vùi thu được cao nhất, đạt tới 2,35 x 1010
OB/ml và tỷ lệ thu hồi thể vùi tới 83,93%. Tạo
dạng sử dụng chế phẩm với liều lượng 500
gam/ha dưới dạng bột thấm nước có hàm
lượng thể vùi 2,0 x 109 OB/gam, tương đương
1 x 1012 OB/ha cho hiệu quả gây chết sâu
khoang trong điều kiện phòng thí nghiệm đạt
81,23% với chế phẩm không bổ sung Boric và
đạt 87,14% với chế phẩm có bổ sung thêm 5%
axit Boric, đạt tới 81,13 % và 82,92% (tương
ứng) trong điều kiện nhà lưới ở thời điểm 7
ngày sau phun.
Lời cảm ơn: Chúng tôi xin chân thành cảm ơn Ban quản lý chương trình Công nghệ sinh học nông
nghiệp (Bộ Nông nghiệp và PTNT) đã tạo điều kiện tài chính và Trung tâm Sinh học (Viện Bảo
vệ thực vật) đã tạo điều kiện thuận lợi về thiết bị máy móc để tiến hành các thí nghiệm trong nghiên
cứu nói trên.
Tài liệu tham khảo
Cisneros J., Perez J. A., Penagos D. I., Ruiz J. V. Cabellero P. Cave R. D. and Williams T. (2002).
Formulation of a nucleopolyhedrosis with Boric acid for control of Spodoptera frugiperda
(Lepidoptera: Noctuidae) in maize. J. of Biological Control, 23, 87- 95.
20 Lê T. H. Hà và Lê V. Trịnh. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 14(2), 12-20
Grzywacz R. R.J., Brown M., Jones A.K, Parnell M. (1996). The Helicoverpa armigera NPV
production manual, Book of Instruction manual. Academic Press, New York, 66 pps.
Huda N., Sajap A. S. and Lau W. H. (2012). Stability of Spodoptera litura nucleopolyhedrosis
virus in Sodium Dodecyl Sulphate. African Journal of Biotechnology, 11(16), 3877- 3881.
Nguyễn Văn Cảm, Hoàng Thị Việt, Huger A.M. (1996). Một số Baculovirut gây bệnh trên sâu hại
thuộc Bộ Lepidoptera ở Việt Nam. Tuyển tập công trình nghiên cứu biện pháp sinh học phòng
trừ dịch hại cây trồng (1990- 1995). NXB Nông nghiệp. Trang 17- 23.
Sajap A. S., Kotulai J. R., Bakir M. A., Hong L. W., Samad N.A. and Kadir H. A. (2000).
Pathogenicity and characteristis of Spodoptera litura Nucleopolyhedrovirus from Peninsular
Malaysia. Journal of Tropical Agricultural Sciences, 23(1), 23- 28.
Senthil Kumar CM, Sathiah N, Rabindra RJ (2005). Optimizing the time of harvest of
Nucleopolyhedrovirus infected Spodoptera litura (Farbricius) larvae under in vivo production
systems. Curent Sciences, 88(10), 1682-1684.
Shapiro M. and Shepard B. M. (2007). Evaluation of clays and fluorescent brightener upon the
activity of the Gypsy Moth (Lepidoptera: Lymantridae) nucleopolyhedrovirus. Journal of
Agricultural and Uban Entomology, 24(4), 165- 175.
9 trang
08/01/2024
6480
Bạn đang xem tài liệu "Nghiên cứu tinh sạch thể vùi Nucleo polyhedrosis virus (NPV) sâu khoang và tạo dạng chế phẩm", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên
File đính kèm:
- nghien_cuu_tinh_sach_the_vui_nucleo_polyhedrosis_virus_npv_s.pdf
