Phân lập và xác định một số đặc điểm sinh học các chủng Streptococus agalactiae gây bệnh trên cá rô phi đỏ (Oreochromis sp.) nuôi tại Thừa Thiên Huế
TẠP CHÍ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ NÔNG NGHIỆP
ISSN 2588-1256
Tập 3(3) – 2019: 1591-1601
PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CÁC CHỦNG
Streptococus agalactiae GÂY BỆNH TRÊN CÁ RÔ PHI ĐỎ (Oreochromis sp.) NUÔI
TẠI THỪA THIÊN HUẾ
Nguyễn Ngọc Phước*, Trần Thị Nhật Anh, Nguyễn Thị Huế Linh
*Tác giả liên hệ:
TÓM TẮT
Nguyễn Ngọc Phước
Email:
Streptococcus agalactiae là một trong những tác nhân chính gây
bệnh trên cá diêu hồng hay rô phi đỏ (Oreochromis sp.) nuôi trên thế
giới. Nghiên cứu này đã phân lập được 27 chủng cầu khuẩn
Streptococus trên cá rô phi bị bệnh nuôi tại thị xã Hương Trà và
Hương Thủy, tỉnh Thừa Thiên Huế. Cá rô phi bị bệnh có các dấu
hiệu bệnh lý đặc trưng như mắt lồi, bơi xoắn ốc, xuất huyết ở các
gốc vây và viêm màng não. Kết quả định danh bằng phản ứng ngưng
kết kháng nguyên (Lancefield test) cho thấy tất cả 27 chủng này đều
là vi khuẩn S. agalactiae nhóm B, các chủng vi khuẩn này có hình
cầu, phản ứng âm tính với oxidase, catalase, bile esculine và gây tan
huyết hoàn toàn (tan huyết β) trên môi trường thạch máu. Các chủng
vi khuẩn phân lập được khá đồng nhất về đặc điểm sinh hóa. Liều
gây chết 60% đối với cá rô phi thí nghiệm của các chủng HT 1.1 là
5 x 104 cfu/mL, chủng HTH 2.3 và chủng BD 1.2 là 2 x 104 cfu/mL.
Trường Đại học Nông Lâm,
Đại học Huế
Nhận bài: 27/08/2019
Chấp nhận bài: 14/10/2019
Từ khóa: Cá rô phi,
Oreochromis sp., Streptococcus Các chủng vi khuẩn S. agalactiae phân lập được trên cá rô phi đỏ
agalactiae, Tan huyết β, Thừa
Thiên Huế
nuôi tại Thừa Thiên Huế nhạy cảm với các loại kháng sinh
ampicillin, amoxicillin và oxacillin.
1. MỞ ĐẦU
tại An Giang và Vĩnh Long rất cao, tỉ lệ cảm
nhiễm vi khuẩn này trên cá rô phi từ 95 -
100% và gây ra thiệt hại nặng nề về kinh tế
cho người nuôi (Đinh Thị Thủy, 2007). Ở
miền Bắc, vi khuẩn S. agalactiae cũng là tác
nhân gây bệnh chính gây ra tỷ lệ chết cao
trên cá rô phi nuôi vào mùa khô với tỷ lệ
chết trung bình lên đến 45% và là nguyên
nhân chính là sụt giảm nghiêm trọng về sản
lượng cá rô phi tại các tỉnh phía Bắc trong
năm 2009 (Đồng Thanh Hà, 2010). Tại thừa
Thiên Huế, cá rô phi (Oreochromis sp.) là
đối tượng nước ngọt được nuôi phổ biến ở
các hồ chứa và lưu vực các sông như sông
Bồ, sông Hương, là nguồn thu nhập chính
cho người dân địa phương. Trong những
năm gần đây, dịch bệnh trên cá rô phi nuôi
tại tỉnh Thừa Thiên Huế xảy ra thường
xuyên với dấu hiệu bệnh lý điển hình do vi
Cá rô phi đỏ hay còn gọi là cá diêu
hồng (Oreochromis sp.) thuộc họ Cichlida,
bộ Perciformes là đối tượng được nuôi ở rất
nhiều nước trên thế giới và là mặt hàng thực
phẩm có giá trị trên toàn cầu. Tuy nhiên
nghề nuôi cá rô phi đang đối mặt với nhiều
thách thức, đặc biệt là dịch bệnh do bệnh
truyền nhiễm gây ra. Liên cầu khuẩn
(Streptococcus sp.) là tác nhân gây ra thiệt
hại lớn đối với nghề nuôi cá rô phi trên thế
giới (Shoemak và cs., 2008). Trong vòng 7
ngày, nhóm vi khuẩn này có thể gây ra tỷ lệ
chết lên đến 70% trên cá rô phi dẫn đến
những thiệt hại về kinh tế hết sức trầm trọng
đối với người nuôi (Wongsathein, 2012).
Tại Việt Nam, tần suất xuất hiện vi khuẩn
Streptococcus agalactiae trên cá rô phi nuôi
1591
HUAF JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCE & TECHNOLOGY
ISSN 2588-1256 Vol. 3(3) – 2019: 1591-1601
khuẩn S. agalactiae gây ra như mắt bị lồi
đục và tỷ lệ chết lên đến 60-70% trong 5-7
ngày. Tuy nhiên, vẫn chưa có một nghiên
cứu cụ thể nào về dịch bệnh này trên cá rô
phi nuôi tại Thừa Thiên Huế. Vì vậy, nghiên
cứu này nhằm phân lập, xác định đặc điểm
sinh hoá và đánh giá khả năng mẫn cảm
kháng sinh của chủng vi khuẩn S. agalactiae
gây bệnh trên cá rô phi nuôi, góp phần hạn
chế dịch bệnh và nâng cao năng suất cá nuôi
tại tỉnh Thừa Thiên Huế.
phương pháp Lancefield (Lancefield, 1933)
với bộ kit Strep-B-Latex (GBS) (Đan Mạch)
với các bước như sau:
Đầu tiên lấy hai giọt dung dịch latex
(khoảng 10 µL/giọt) nhỏ lên giấy thử theo
từng nhóm A, B, C, D, F, G. Dùng que cấy
tiệt trùng lấy khoảng từ 3-5 khuẩn lạc cho
vào 3 mL nước muối sinh lý, sau đó cho 100
µL dung dịch lysis vào và ủ ở nhiệt độ 55oC
trong 10 phút ở nồi cách thủy, tiếp theo nhỏ
một giọt dung dịch vi khuẩn lên các nhóm
A, B, C, D, F và G tương ứng. Dùng tăm tiệt
trùng trộn đều 2 dung dịch. Phản ứng dương
tính sẽ có ngưng kết xuất hiện trong 5 – 10
giây.
2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Địa điểm thu mẫu
Mẫu cá bệnh được thu trực tiếp tại 08
hộ nuôi cá rô phi đỏ (Oreochrmis sp.) lồng
tại phường Tứ Hạ (4 hộ) và xã Bình Điền (2
hộ) thuộc thị xã Hương Trà và phường Phú
Bài (2 hộ) thuộc thị xã Hương Thủy trong
tháng 4 và tháng 5 năm 2018. Tại mỗi hộ
tiến hành thu 3-5 con cá có dấu hiệu bệnh lý
điển hình để quan sát các dấu hiệu bệnh lý
bên ngoài và dấu hiệu bệnh tích bên trong
cơ thể.
Kết quả: Nếu phản ứng ngưng kết xảy
ra ở:
Nhóm A: vi khuẩn Streptococcus
pyogenes
Nhóm B: vi khuẩn Streptococcus
agalactiae
Nhóm C: vi khuẩn Streptococcus
equi
2.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn
Nhóm D: vi khuẩn Enterococci
Tiến hành thu mẫu chọn lọc: thu mẫu
cá có các biểu hiện như bơi lội không bình
thường, vận động khó khăn không định
hướng, bơi gần mặt nước, bơi vòng tròn
hoặc đớp không khí, mắt lồi và đục, có xuất
huyết ở các vây và xương nắp mang
(Abuseliana và cs., 2010).
Nhóm F: vi khuẩn Streptococcus
anginosus
Nhóm G: vi khuẩn Streptococcus
constelatus
2.4. Phương pháp xác định một số đặc
điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn
phân lập được
Thu mẫu vi khuẩn được tiến hành tại
hiện trường bằng cách dùng dao mổ đã được
tiệt trùng bằng cồn 90o, mổ hộp sọ của cá,
dùng que cấy nhựa tiệt trùng đâm thẳng vào
khối não rồi cấy lên môi trường Tryptone
Soya Agar (TSA, HiMedia, Ấn Độ) đã được
chuẩn bị sẵn. Dùng parafin bao kín lại và giữ
ở nhiệt độ 28oC trong 24 giờ.
Các phản ứng cơ bản gồm có: nhuộm
Gram, oxidase, phản ứng oxi hoá/lên men
đường Glucose (O/F glucose), khả năng tan
huyết trên môi trường thạch có chứa 5%
máu ngựa, khả năng mọc ở môi trường TSB
+
6.5% NaCl, phản ứng Lysine
decarboxylase (LDC), khả năng làm kết tủa
huyết thanh thỏ đông khô và phản ứng Bile-
esculine được tiến hành theo hướng dẫn của
công ty Nam Khoa (Việt Nam). Xác định
khả năng di động và phản ứng catalase được
2.3. Phương pháp định danh vi khuẩn
bằng kiểu huyết thanh
Kiểu huyết thanh được xác định bằng
phương pháp ngưng kết miễn dịch theo
1592
Nguyễn Ngọc Phước và cs.
TẠP CHÍ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ NÔNG NGHIỆP
ISSN 2588-1256
Tập 3(3) – 2019: 1591-1601
tiến hành theo phương pháp của
Wongsathien (2012). Ngoài ra, đặc điểm
sinh hóa các chủng vi khuẩn phân lập cũng
được tiến hành trên bộ kit API 20 Strep
(analytical profile index) (Bio-Mérieux,
Pháp) theo hướng dẫn của sản phẩm và nuôi
cấy ở nhiệt độ 28oC, đọc kết quả sau 24 giờ.
Chủng vi khuẩn S. agalactiae NCIMB
701348 được sử dụng để làm kết quả so
sánh.
Trước khi tiến hành thí nghiệm cảm
nhiễm, đàn cá được kiểm tra không cảm
nhiễm vi khuẩn bằng cách thu mẫu vi khuẩn
từ não của 5 con cá ngẫu nhiên. Dùng que
cấy nhựa tiệt trùng đâm thẳng vào khối não
của cá rồi cấy lên môi trường TSA đã được
chuẩn bị sẵn. Dùng parafin bao kín lại và giữ
ở nhiệt độ 28oC trong 24 giờ.
2.5.3. Phương pháp công cường độc lực
Lấy khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn
S.agalactiae đã được phân lập, tiến hành
nuôi tăng sinh trong TSB trong 24 giờ. Dung
dịch huyền phù sau 24 giờ nuôi cấy được ly
tâm ở tốc độ 4.000 vòng/phút trên máy ly
2.5. Phương pháp gây bệnh thực nghiệm
2.5.1. Chuẩn bị vi khuẩn
Chủng vi khuẩn S. agalactiae sau khi
công cường độc lực được nuôi cấy trên môi
trường thạch TSA ở nhiệt độ 28oC trong 24
giờ. Sau đó, lấy 1 khuẩn lạc rời trên đĩa
thạch nuôi cấy tăng sinh trong 10 mL môi
trường Tryptone Soya Broth (TSB,
HiMedia, Ấn Độ) trong máy ủ lắc (LM-
4200, Yinder, Trung Quốc) ở nhiệt độ 28oC,
tốc độ 100 vòng/phút trong 24 giờ. Dung
dịch vi khuẩn được li tâm với tốc độ 3000
vòng trong 20 phút bằng máy ly tâm
(Digisystem Laboratory Instruments Inc.,
Đài Loan), loại bỏ phần dịch nổi và thu phần
vi khuẩn. Cho 10 mL dung dịch nước muối
sinh lý 0.85% NaCl vào để tạo huyền phù.
Lấy 1 mL huyền phù vi khuẩn đo OD bằng
máy so màu quang phổ (Spectrophotometer
model 4111 RS, Zuzi, Tây Ban Nha) ở bước
sóng 620 nm, dùng nước muối sinh lý pha
tâm
(Lab
Centrifuge,
Digisystem
Laboratory, Đức). Loại bỏ phần dịch nổi,
sau đó cho thêm 1 mL nước muối sinh lý
(0,86 % NaCl), trộn đều trên máy Vortex.
Lấy 0.1 mL dung dịch vi khuẩn trên tiêm
cho cá.
Sau 1-2 ngày, nếu cá chết thì tiến
hành thu mẫu vi khuẩn bằng cách lấy que
cấy vô trùng đưa vào não cá, sau đó cấy lên
đĩa petri có chứa môi trường TSA. Ủ 24 giờ
ở nhiệt độ 30oC. Vi khuẩn thu được sau khi
định danh lại là S. agalactiae bằng phản ứng
sinh hoá được lưu giữ trong Glycerol 15%
và bảo quản ở -20oC ở tủ lạnh sâu để dùng
cho các thí nghiệm cảm nhiễm (Nguyễn
Ngọc Phước và cs., 2015). Các chủng gây
chết cá sau 24 giờ được chọn để xác định
liều gây chết LD60.
loãng đến giá trị OD của huyền phù OD620
=
1 (tương đương 108 cfu/mL, số liệu không
công bố). Sau đó pha loãng vi khuẩn theo
các mật độ từ 103-108 cfu/mL.
2.5.4. Thí nghiệm xác định liều gây chết
60% (LD60- Lethal dose 60)
Từ kết quả của thí nghiệm công
cường độc lực, 3 chủng vi khuẩn S.
agalactiae phân lập tại phường Tứ Hạ, xã
Bình Điền (thị xã Hương Trà), và phường
Phú Bài (thị xã Hương Thủy) là S.
agalactiae HT1.1, HTH 2.3 và BĐ 1.2 được
chọn để xác định liều gây chết LD60. Thí
nghiệm xác định giá trị LD60 được bố trí trên
2.5.2. Cá thí nghiệm
Cá sử dụng cho thí nghiệm cảm
nhiễm là cá rô phi đỏ (Oreochromis sp.) có
trọng lượng khoảng 30 g/con, khỏe mạnh
được cung cấp từ Trung tâm giống thuỷ sản
Thừa Thiên Huế. Cá được nuôi thuần 14
ngày trước khi thí nghiệm.
1593
HUAF JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCE & TECHNOLOGY
ISSN 2588-1256 Vol. 3(3) – 2019: 1591-1601
7 nghiệm thức bao gồm: 6 nghiệm thức thí
nghiệm và 1 nghiệm thức đối chứng. Mỗi
nghiệm thức gồm 10 con cá được nuôi trong
bể nhựa (V = 50 L). Cá trước khi cảm nhiễm
được gây mê bằng AquiS (Bayer, Việt Nam)
với liều lượng 0.02 mL/L nước. Cá được
cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm vào
xoang bụng. Trong 6 nghiệm thức thí
nghiệm: cá ở mỗi nghiệm thức được tiêm
0,1 mL với một trong sáu mật độ vi khuẩn
S. agalactiae từ 1 x 108 đến 1 x 103 cfu/mL.
Ở nghiệm thức đối chứng, cá được tiêm 0.1
mL nước muối sinh lý (0.85% NaCl) vô
trùng. Cá sau khi tiêm được nuôi trong bể
nhựa 50 L với hệ thống nước chảy tốc độ 14
L/ phút, nhiệt độ duy trì trong khoảng 28-
30oC. Cho ăn bằng thức ăn Cargill (Việt
Nam) ở mức duy trì (3% trọng lượng thân).
Sục khí liên tục 24 giờ/ngày. Tỷ lệ chết được
theo dõi trong 14 ngày. Giá trị LD60 được
xác định theo phương pháp của Reed-
Muench.
khuẩn được kiểm tra bằng phương pháp
khuếch tán trên đĩa thạch theo phương pháp
của Kirby Bauer và cs. (1966).
Dùng que cấy tiệt trùng lấy khuẩn lạc
trên đĩa vi khuẩn cho vào ống nghiệm chứa
10 mL nước muối sinh lý (0,86% NaCl) đã
tiệt trùng. Trộn đều và xác định mật độ vi
khuẩn đạt 108 cfu/mL, lấy 100 L huyền phù
vi khuẩn cấy trên môi trường Mueller
Hinton (Himedia, Ấn độ), để khô khoảng 10
phút sau đó đặt các khoanh giấy có tẩm các
loại kháng sinh ofloxacin, tetracycline,
oxacillin,
ampicillin,
amocillin
và
streptomycinlên đĩa thạch, nuôi cấyở nhiệt độ
28oC. Tiến hành đo đường kính vòng vô
khuẩn sau 24 giờ. Đánh giá khả năng nhạy
cảm hay kháng kháng sinh của vi khuẩn dựa
trên dựa trên đường kính vòng vô khuẩn
theo tiêu chuẩn của Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI, 2016).
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả phân lập và định danh vi
khuẩn bẳng kiểu huyết thanh
Dựa vào số lượng cá chết ở các
nghiệm thức để tính LD60 theo công thức
sau:
Từ các mẫu cá rô phi bị bệnh nuôi tại
4 hộ nuôi cá lồng trên sông Bồ, phường Tứ
Hạ, 2 hộ nuôi cá lồng ở xã Bình Điền (thị
Hương Trà), 2 hộ nuôi cá rô phi lồng ở hồ
chứa Phú Bài, phường Phú Bài (thị xã
Hương Thuỷ) thuộc tỉnh Thừa Thiên Huế đã
phân lập được 27 chủng vi khuẩn. Kết quả
phân lập và định danh 27 chủng vi khuẩn từ
não của mẫu cá bệnh được trình bày ở bảng
1.
LD60 = 10a-x
Trong đó:
- a là số luỹ thừa mà tại đó vi khuẩn
gây cá chết thấp nhất (trên 60%)
- x được tính dựa vào công thức: x =
(Pa – 60)/(Pa – Pu)
Với: Pa là tỷ lệ chết cận trên và Pu là
tỷ lệ chết cận dưới của liều gây chết 60%
30 mẫu cá rô phi thu được có biểu
hiện bệnh như: cá bệnh bơi lờ đờ, hoạt động
chậm chạp, kém linh hoạt, bơi lội mất
phương hướng, mắt lồi và đục (Hình 1).
2.6. Phương pháp thử độ nhạy kháng
sinh
Khả năng mẫn cảm kháng sinh của vi
1594
Nguyễn Ngọc Phước và cs.
TẠP CHÍ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ NÔNG NGHIỆP
ISSN 2588-1256
Tập 3(3) – 2019: 1591-1601
Bảng 1. Kết quả định danh bằng kiểu huyết thanh (Lancefield) từ các mẫu cá bệnh thu tại các lồng
nuôi ở thị xã Hương Trà và Hương Thuỷ, tỉnh Thừa Thiên Huế
Địa điểm thu mẫu
Mẫu thu
HT 1.1
Kiểu huyết thanh (Lancefield ) Kết quả định danh (chủng)
Streptococcus agalactiae HT1.1
Hộ 1
Nhóm B
Nhóm B
Nhóm B
Nhóm B
HT 1.2
HT 1.3
HT 2.1
S. agalactiae HT1.2
S. agalactiae HT1.3
S. agalactiae HT2.1
S. agalactiae HT2.2
S. agalactiae HT2.3
S. agalactiae HT3.1
S. agalactiae HT3.2
S. agalactiae HT3.3
S. agalactiae HT4.1
S. agalactiae HT4.2
S. agalactiae HT4.3
S. agalactiae HHT1.1
S. agalactiae HHT1.2
S. agalactiae HHT1.3
S. agalactiae HHT1.4
Hộ 2 HT 2.2
HT 2.3
Phường Tứ Hạ
HT 3.1
Hộ 3 HT 3.2
HT 3.3
HT 4.1
Hộ 4 HT 4.2
HT 4.3
HTH 1.1
HTH 1.2
HTH 1.3
HTH 1.4
Hộ 1
Nhóm B
Nhóm B
Phường Phú Bài
HTH 2.1
S. agalactiae HHT2.1
Hộ 2
HTH 2.2
HTH 2.3
BĐ 1.1
S. agalactiae HHT2.2
S. agalactiae HHT2.3
S. agalactiae BĐ1.1
S. agalactiae BĐ1.2
S. agalactiae BĐ1.3
S. agalactiae BĐ1.4
S. agalactiae BĐ1.5
S. agalactiae BĐ2.1
S. agalactiae BĐ2.2
S. agalactiae BĐ2.3
BĐ 1.2
Hộ 1 BĐ 1.3
BĐ 1.4
Nhóm B
Nhóm B
Xã Bình Điền
BĐ 1.5
BĐ 2.1
Hộ 2 BĐ 2.2
BĐ 2.3
Hình 1. Cá rô phi bị bệnh với dấu hiệu đặc trưng là mắt lồi đục (vòng tròn)
1595
HUAF JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCE & TECHNOLOGY
ISSN 2588-1256 Vol. 3(3) – 2019: 1591-1601
Tất cả các chủng vi khuẩn phân lập
được đều tạo ra các khuẩn lạc tròn, đều, màu
trắng sữa trên môi trường TSA (Hình 2A),
gây khả năng tan huyết hoàn toàn (tan huyết
β) trên môi trường thạch máu (BA) (Hình
2B) và tạo phản ứng ngưng kết nhóm B
Lancefield (Hình 3).
Hình 2. Khuẩn lạc các chủng vi khuẩn phân lập có màu trắng, nhỏ và tròn trên môi trường TSA (A)
và gây tan huyết β trên môi trường thạch máu (BA) (B)
Phản ứng ngưng kết miễn dịch dựa trên
nguyên tắc của sự liên kết giữa kháng
nguyên và kháng thể có thể nhìn thấy được
ở dạng kết tủa (Gella và cs., 1991). Trong
nghiên cứu này, phản ứng ngưng kết miễn
dịch giúp phát hiện nhanh và nhận dạng kiểu
huyết thanh của vi khuẩn S. agalactiae. Kết
quả cho thấy có 27/27 các chủng vi khuẩn
(chiếm 100%) cho kết quả dương tính giúp
xác định các chủng vi khuẩn phân lập được
là S. agalactiae nhóm B (Hình 3).
Hình 3. Phản ứng xác định kiểu huyết thanh theo nhóm Lancefield của chủng vi khuẩn phân lập được
từ cá rô phi bệnh cho thấy phản ứng ngưng kết xảy ra ở nhóm B
3.2. Kết quả kiểm tra đặc điểm sinh hóa
các chủng vi khuẩn phân lập được
tại Thừa Thiên Huế khá đồng nhất về mặt
sinh hóa (Bảng 2). 100% các chủng cho
phản ứng âm tính với catalase, Bile Esculine
và oxidase. Tất cả các chủng không phát
triển trong môi trường TSB 6,5% NaCl.
Phản ứng với huyết tương thỏ đông khô cho
kết quả 100% chủng có khả năng gây ngưng
kết hoàn toàn. 100% các chủng cho phản
Từ các đặc tính sinh hoá đặc trưng
của Streptococcus spp. là các phản ứng:
catalase, oxidase, huyết tương thỏ đông khô,
LDC, TSB 6,5% NaCl, bile esculine cho
thấy 27 chủng S. agalactiae phân lập được
1596
Nguyễn Ngọc Phước và cs.
TẠP CHÍ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ NÔNG NGHIỆP
ISSN 2588-1256
Tập 3(3) – 2019: 1591-1601
ứng dương tính với Lysine decarboxylase
(LDC). Kết quả này hoàn toàn phù hợp với
nghiên cứu về đặc tính sinh học của vi khuẩn
Streptococcus spp. gây bệnh xuất huyết ở cá
rô phi nuôi tại một số tỉnh miền Bắc Việt
Nam của Phạm Hồng Quân vào năm 2013.
đường arabino, manitol, sorbitol, và inulin.
Chỉ có 2/27 chủng (11.1%) có khả năng sử
dụng đường rafinose, glycogen và
amygdalin. Có 25/27 chủng (chiếm 92.5%)
cho phản ứng dương tính với Voges-
Proskauer. Các sai khác về đặc điểm sinh
hóa giữa các chủng S. agalactiae phân lập
được tại Thừa Thiên Huế so với chủng S.
agalactiae NCIMB 701348 có thể do khi sử
dụng các kit sinh hóa được thương mại hóa
cho độ nhạy không cao so với các phương
pháp khác (Bader và cs., 1998).
Các môi trường đường sử dụng đều
cho kết quả khá đồng nhất giữa các chủng
phân lập được (Bảng 2). Tất cả các chủng
phân lập được có khả năng sử dụng đường
ribose, lactose và trehalose. 100% các chủng
phân lập được không có khả năng sử dụng
Bảng 2. Đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn Streptococcus spp. phân lập được từ cá rô phi bị
bệnh và chủng S. agalactiae NCIMB 701348 được sử dụng để làm kết quả so sánh
Tỷ lệ % chủng vi khuẩn
Streptococcus agalactiae
phân lập
Dương tính
100
Chỉ tiêu
NCIMB 701348
Âm tính
0
Nhuộm Gram
Hình thái
(+)
Hình cầu
Không
Hình cầu
Không
Di động
Khả năng tan huyết
Oxidase
β
(-)
100 (β)
100
100
100
Catalase
(-)
(-)
Bile Esculine
Huyết tương thỏ đông khô
(+)
100
LDC
Voges-Proskauer
(+)
(+)
100
92,5
7,5
Hypurate hydrolysis
Pyrolidonylarylamidase
Ribose
(+)
(-)
(+)
(-)
(-)
(-)
(+)
(+)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
89,9
11,1
100
11,1
88,9
Arabinose
100
100
100
Manitol
Sorbitol
Lactose
100
100
Trehalose
Inulin
100
88,9
88,9
88,9
100
Rafinose
11,1
11,1
11,1
Glycogen
Amygdalin
TSB 6.5% NaCl
(+): phản ứng dương tính; (-) phản ứng âm tính
1597
HUAF JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCE & TECHNOLOGY
ISSN 2588-1256 Vol. 3(3) – 2019: 1591-1601
3.3. Kết quả gây bệnh thực nghiệm trên
cá rô phi
1.2 trên cá rô phi (Oreochromis sp.) ở các
mật độ vi khuẩn khác nhau được thể hiện ở
Bảng 3, 4 và 5.
Khả năng gây chết của chủng vi
khuẩn S. agalactiae HT 1.1, HTH 2.3 và BD
Bảng 3. Tỷ lệ chết cộng dồn ở các lô thí nghiệm khi cảm nhiễm vi khuẩn S. agalactiae HT 1.1 với các
mật độ pha loãng khác nhau
Số cá
Tổng số cộng dồn
Nồng độ pha Mật độ vi khuẩn
Tỷ lệ chết
Tổng cộng dồn (%)
loãng
0
(cfu/mL)
Chết
10
9
9
7
Sống
Chết
45
35
26
17
10
4
Sống
0
1
2
5
108
0
1
1
3
4
6
45
36
28
22
19
19
100
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
107
97,22
92,86
77,27
52,63
21,05
106
105
104
6
4
9
15
103
khuẩn S. agalactiae HT1.1 được xác định là
5 x 104 cfu/mL.
Từ kết quả Bảng 3, liều gây chết
60% số cá thí nghiệm (LD60) của chủng vi
Bảng 4. Tỷ lệ chết cộng dồn ở các lô thí nghiệm khi cảm nhiễm vi khuẩn S. agalactiae HTH 2.3 với
các mật độ pha loãng khác nhau
Số cá
Tổng số cộng dồn
Nồng độ pha Mật độ vi khuẩn
Tỷ lệ chết
Tổng cộng dồn (%)
loãng
0
(cfu/mL)
Chết
10
9
9
8
Sống
Chết
45
35
26
17
9
Sống
0
1
2
4
108
0
1
1
2
5
6
45
36
28
21
18
19
100
97,22
92,86
80,95
50
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
107
106
105
104
5
4
9
103
4
15
15
khuẩn S. agalactiae HTH 2.3 được xác định
là 2 x 104 cfu/mL.
Từ kết quả Bảng 4, liều gây chết
60% số cá thí nghiệm (LD60) của chủng vi
Bảng 5. Tỷ lệ chết cộng dồn ở các lô thí nghiệm khi cảm nhiễm vi khuẩn S. agalactiae BD 1.2 với các
mật độ pha loãng khác nhau
Số cá
Tổng số cộng dồn
Nồng độ pha Mật độ vi khuẩn
Tỷ lệ chết
Tổng cộng dồn (%)
loãng
0
(cfu/mL)
Chết
10
9
8
7
Sống
Chết
43
33
24
16
9
Sống
0
1
3
6
108
0
1
2
3
4
7
43
34
27
22
19
20
100
97,05
88,9
72,72
47,36
15
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
107
106
105
104
6
3
10
17
103
3
cfu/mL.
Từ kết quả Bảng 5, liều gây chết 60%
số cá thí nghiệm (LD60) của chủng vi khuẩn
S. agalactiae BĐ 1.2 được xác định là 2 x
104 cfu/mL.
Các dấu hiệu bệnh lý ở cá rô phi khi
gây bệnh thực nghiệm là mắt lồi và mờ
đục, não bị xuất huyết trong nghiên cứu
này hoàn toàn giống với các dấu hiệu bệnh
lý đặc trưng của bệnh do vi khuẩn
Streptococcus gây ra trên cá rô phi
(Abuseliana và cs., 2010; Anshary và cs.,
2014).
Kết quả tiến hành cảm nhiễm gây
bệnh thực nghiệm bằng các chủng vi khuẩn
đã phân lập được cho thấy độc lực vi khuẩn
S. agalactiae phân lập trên cá rô phi nuôi
tại Thừa Thiên Huế khá giống nhau,
ngưỡng gây chết 60% từ 2 x 104 – 5 x 104
1598
Nguyễn Ngọc Phước và cs.
TẠP CHÍ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ NÔNG NGHIỆP
ISSN 2588-1256
Tập 3(3) – 2019: 1591-1601
3.5 Kết quả thử khả năng mẫn cảm đối
với một số loại kháng sinh
Trong 8 loại kháng sinh được sử dụng để thử
nghiệm cho thấy S. agalactiae mẫn cảm cao
với hai loại kháng sinh ofloxacin và
amocillin (Bảng 6). Trong khi đó có tới
66.7% các chủng vi khuẩn kháng với
ampicilin.
Kết quả thử khả năng mẫn cảm của S.
agalactiae với 6 loại kháng sinh ofloxacin,
tetracycline, oxacillin, ampicillin, amocillin
và streptomycin được thể hiện ở Bảng 6.
Bảng 6. Độ mẫn cảm kháng sinh của các chủng vi khuẩn S. agalactiae phân lập tại Thừa Thiên Huế
Tỷ lệ % S. agalactiae
Kháng sinh
Nhạy cảm
96,3
Kháng
3,7
Ofloxacin
Tetracycline
Oxacillin
40,7
50
59,3
50
Ampicilin
Amocillin
33,3
92,5
66,7
7,5
Streptomycin
63,9
36,1
Ofloxacin
thuộc
nhóm
agalactiae khá đồng nhất về mặt sinh hóa.
Các chủng vi khuẩn phát triển trên môi
trường TSA sau 24 giờ ở 28oC tạo khuẩn lạc
nhỏ, hình tròn, có màu kem, và gây tan
huyết trên môi trường thạch máu. Các chủng
này đều là vi khuẩn Gram dương, hình cầu,
không di động, oxidase và catalase âm tính.
fluoroquinolon có tác dụng diệt khuẩn cao
đối với Gram (+) nên có thể sử dụng loại
kháng sinh này trong điều trị bệnh do vi
khuẩn S. agalactiae gây ra trên cá nuôi.
Ampicilline, amoxicillin và oxacillin đều
thuộc nhóm β-lactam có phổ kháng khuẩn
trung bình, tác dụng mạnh trên vi khuẩn
Gram (+). Kết quả nghiên cứu của
Abuseliana và cs. (2010) cũng cho thấy hai
loại kháng sinh ampicilline và amoxicillin
đều có khả năng mẫn cảm với S. agalactiae.
Trong nghiên cứu này, S. agalatiae phân lập
trên cá rô phi ở Thừa Thiên Huế đều mẫn
cảm với 3 loại kháng sinh thuộc nhóm β-
lactam trong đó amocillin có tác dụng mạnh
nhất. Tetracycline là loại kháng sinh được
dùng phổ biến trong nuôi trồng thủy sản, và
trong nghiên cứu này có tới 40.7% chủng vi
khuẩn nhạy với loại kháng sinh này. Tuy
nhiên, theo nghiên cứu của Atalay và cs.
(2011) thì tetracycline không có tác dụng
với vi khuẩn S. agalactiae do vậy không nên
sử dụng loại kháng sinh này để điều trị bệnh
do vi khuẩn S. agalactiae gây ra trên cá
nuôi.
Liều gây chết 60% cá thí nghiệm của
các chủng S. agalactiae phân lập được trên
cá rô phi nuôi tại Thừa Thiên Huế là 2 x 104
– 5 x 104 cfu/mL.
Các chủng vi khuẩn S. agalactiae
phân lập được trên cá rô phi nuôi tại Thừa
Thiên Huế nhạy cảm với các loại kháng sinh
ampicillin, amoxicillin và ofloxacin.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.Tài liệu tiếng Việt
Đồng Thanh Hà, Nguyễn Viết Khuê và Nguyễn
Thị Hạnh. (2010). Một số đặc điểm của
Streptococcus agalactiae, tác nhân gây bệnh
Streptococcosistrêncá rô phiở miềnBắc Việt
Nam. Báo cáo khoa học - Trung tâm nghiên
cứu quan trắc cảnh báo môi trường và phòng
ngừa dịch bệnh thủy sản miền Bắc – Viện
Nghiêncứu Nuôitrồng ThủySản I.
Nguyễn Ngọc Phước, Lưu Thị Ngọc Hạnh,
Nguyễn Thị Sao, Nguyễn Đức Quỳnh Anh,
Trương Thị Hoa và Lê Văn Bảo Duy. (2015).
Nghiên cứu một số đặc điểm sinh hóa vi
khuẩn Streptococus spp. gây bệnh trên cá rô
phi nuôi tại đồng bằng sông Cứu Long, Việt
4. KẾT LUẬN
Nghiên cứu đã phân lập được 27
chủng S. agalactiae gây bệnh trên cá rô phi
nuôi tại tỉnh Thừa Thiên Huế. Các chủng S.
1599
HUAF JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCE & TECHNOLOGY
ISSN 2588-1256 Vol. 3(3) – 2019: 1591-1601
Nam. Tạp chí Khoa học – Đại học Huế, 104
(05), 207-219.
Bauer, A. W., Kirby., W. M., & Sherris, J. C.
(1966). Antibiotic susceptibility testing by a
standardized single disk method. American
Journal of Clinical Pathology, 45, 493 - 496.
Buller, N. B. (2004). Bacteria from fish and
Phạm Hồng Quân, Hồ Thu Thuỷ, Nguyễn Hữu
Vũ, Huỳnh Mỹ Lệ và Lê Văn Khoa. (2013).
Một số đặc tính sinh học của vi khuẩn
Streptococcus spp. gây bệnh xuất huyết ở cá
rô phi nuôi tại một số tỉnh miền Bắc Việt
Nam. Tạp chí khoa học và phát triển, 11 (4),
506-513.
Đinh Thị Thủy. (2007). Nghiên cứu các bệnh
nguy hiểm thường gặp ở cá rô phi nuôi
thâm canh. Hà Nội: Liên hiệp các hội Khoa
học và Kỹ thuật Việt Nam.
other aquatic animals:
a
practical
identification manual. UK (Biddles Ltd,
King’s Lynn): CABI Publishing.
Clinical and Laboratory Standards Institute
(CLSI). (2016). Performance Standards for
Antimicrobial Susceptibility Testing. USA
(Pennsylvania): Clinical and Laboratory
Standards Institute.
2.Tài liệu tiếng nước ngoài
Gella, F. J., Serra J., & Gener, J. (1991). Latex
Abuseliana, A., Mohd, H. D., Aziz, A. S., Bejo,
S. & Alsaid, M. (2010). Streptococcus
agalactiae the etiological agent of mass
agglutination
immunodiagnosis.
Chemical, 63 (8), 1131-1134.
Lancefield, R. C. (1933).
procedures
Pure
in
Applied
&
Mortality
in
farmed
red
Tilapia
A
serological
(Oreochromis sp.). Journal of Animal and
Veterinary Advances, 9(20), 2640-2646.
Anshary, H., Kumiawan, R. A., Sriwulan, S.,
Ramli, R., & Baxa, D. V. (2014). Isolation
and molecular identification of the
etiological agents of Streptococcosis in Nile
tilapia (Oreochromis niloticus) cultured in
net cages in Lake Sentani, Papua, Indonesia.
SpringerPlus, 3, 627.
diferentatiation of human and other groups
of hemolytic Streotococci. Journal of
Experimental Medicine, 57 (4), 571-595.
Shoemaker, C. D., Xu, H., Klesius, P. H., &
Evans, J. (2008). Concurrent infections
(parasitism and bacterial disease) in Tilapia.
Paper presented at the 8th International
Symposium on Tilapia in Aquaculture,
Cairo, Egypt.
Atalay, A., Ölçü., M., & Perçin, D. (2011).
Antibiotic susceptibilities and serotyping of
Wongsathein, D. (2012). Factors affecting
experimental Streptococcus agalactiae
infection in tilapia, Oreochromis niloticus.
Doctoral dissertation of philosophy,
University of Stirling, UK.
clinical
Streptococcus
agalactiae
isolates. Turkey: Department of Medical
Microbiology, Faculty of Medicine, Erciyes
University, Kayseri.
1600
Nguyễn Ngọc Phước và cs.
TẠP CHÍ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ NÔNG NGHIỆP
ISSN 2588-1256
Tập 3(3) – 2019: 1591-1601
ISOLATION AND BIO-CHEMICAL CHARACTERISTICS OF
Streptococcus agalactiae FROM DISEASED RED TILAPIA
IN THUA THIEN HUE PROVINCE
Nguyen Ngoc Phuoc*, Tran Thi Nhat Anh, Nguyen Thi Hue Linh
*Corresponding Author:
ABSTRACT
Nguyen Ngoc Phuoc
Email:
Streptococcus agalactiae is one of the major pathogens in red
tilapia (Oreochromis sp.) cultured in the world. In this study, 27
isolates of Streptococcus were recovered from diseased red tilapia
that showed characteristically pathological signs such as pop-eyes,
erotic swimming, hemorrhagic and meningitis. All isolates of
Streptococcus were recovered from natural diseased fish on red
tilapia farms including 2 districts (Huong Tra and Huong Thuy,
Thua Thien Hue province). All isolates of Streptococcus were
identified as Group B S. agalactiae by Lancefield test. Biological
characteristics of isolates were homogeneous, consisting of cocci,
non-motile, negative reaction with oxidase, catalase, bile esculine
and showed β haemolytic in the blood agar. The lethal dose of 60%
of S. agalactiae isolate of HT 1.1 was 5 x 104 cfu/mL, and the
isolates of HTH 2.3 and BD 1.2 were 2 x 104 cfu/mL. The result
of the resistant test to antibiotic showed that most of the isolates of
Streptococcus were sensitive to ampicillin, amoxicillin and
oxacillin.
University of Agriculture and
Forestry, Hue University
Received: August 27th, 2019
Accepted: October 14th, 2019
Keywords: Red tilapia,
Oreochromis sp.,
Streptococcus agalactiae, β
haemolytic, Thua Thien Hue
1601
11 trang
09/01/2024
480
Bạn đang xem tài liệu "Phân lập và xác định một số đặc điểm sinh học các chủng Streptococus agalactiae gây bệnh trên cá rô phi đỏ (Oreochromis sp.) nuôi tại Thừa Thiên Huế", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên
File đính kèm:
- phan_lap_va_xac_dinh_mot_so_dac_diem_sinh_hoc_cac_chung_stre.pdf
