Tinh chế kháng thể IGY từ lòng đỏ trứng gà và ứng dụng trong phòng và trị bệnh Gumboro trên gà
Vietnam J. Agri. Sci. 2019, Vol. 17, No. 12: 976-985
Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 2019, 17(12): 976-985
TINH CHẾ KHÁNG THỂ IGY TỪ LÒNG ĐỎ TRỨNG GÀ VÀ
ỨNG DỤNG TRONG PHÒNG VÀ TRỊ BỆNH GUMBORO TRÊN GÀ
Vũ Thị Thu Hằng, Lê Quốc Hòa, Trịnh Thị Bích Ngọc, Vũ Xuân Đăng, Nguyễn Thị Yến,
Nguyễn Văn Tâm, Nguyễn Thị Hoa, Nguyễn Thị Lan, Lê Văn Phan*
Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam
*Tác giả liên hệ: letranphan@vnua.edu.vn
Ngày nhận bài: 27.12.2019
Ngày chấp nhận đăng: 24.02.2020
TÓM TẮT
Mục tiêu của nghiên cứu này là tinh chế kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà và ứng dụng để phòng và điều trị
bệnh Gumboro trên gà. Gà mái giống ISA Brown 16 tuần tuổi được gây tối miễn dịch để tạo ra trứng có hiệu giá
kháng thể cao. Kết quả nghiên cứu đáp ứng miễn dịch cho thấy kháng thể đặc hiệu kháng virus Gumboro tăng
mạnh, đặc biệt là sau khi gây tối miễn dịch với virus cường độc vô hoạt. Hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của gà
đạt mức cao nhất sau 8 tuần tiêm vacxin (giá trị S/P là 2,86 ± 0,068). Tương tự, hiệu giá kháng thể trong lòng đỏ
trứng cũng tăng, giá trị S/P của kháng thể IgY là 2,56 ± 0,11, giá trị S/P của IgY sau tinh chế từ lòng đỏ là 2,60 ± 0,052.
Hiệu giá kháng thể ổn định trong điều kiện bảo quản ở 4C và bổ sung 0,1% sodium benzoate. Kết quả điều trị gà khi
gây bệnh thực nghiệm với virus Gumboro cho thấy việc sử dụng sản phẩm kháng thể IgY tinh chế đem lại hiệu quả
tốt trong phòng trị cho gà: 10/10 gà được tiêm kháng thể IgY trước đó và 9/10 gà được điều trị bằng kháng thể IgY
sống sót sau khi tiêm virus gumboro cường độc, trong khi 9/10 gà lô đối chứng không được tiêm kháng thể đều
bị chết.
Từ khoá: Bệnh Gumboro, IgY tinh khiết, điều trị.
Purification of IgY from Egg Yolk and Its Application for Prevention
and Treatment of Gumboro Disease in Poultry
ABSTRACT
The objective of this study was to purify IgY antibodies from chicken egg yolks and apply them for prevention and
treatment of Gumboro disease in chickens. In this study, ISA Brown layers of 16 weeks old were used for hyper-
immunization to produce eggs with high antibody titers. The immunization results showed that IBD antibody titer sharply
increased, especially after hyper-immunizing. The highest titer in the serum samples was obtained at 8 weeks post first
vaccination (S/P value was 2.86 ± 0.068). Similar with sera, titter of IBD antibody also raised in eggs, S/P value of IgY-
antibody was 2.56 ± 0.111, S/P value of purified IgY from the appropriate yolk was 2.60 ± 0.052. The antibody titer of
purified IgY product was stable at 4C with 0.1% sodium benzoate added. The treatment results of chickens that were
experimentally infected with gumboro virus showed that 10/10 chickens previously received IgY antibody and 9/10
chickens were treated with IgY antibody after challenging gumboro virus were survived and recovered while 9/10
chickens in the control group that did not receive IgY antibody before challenging test were died.
Keywords: Gumboro disease, purified IgY, treatment.
đàn gà từ 10 ngày đến 60 ngày tuổi, song đa số
các đàn gà mắc bệnh đều ở độ tuổi từ 15 đến 30
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
ngày. Tỷ lệ chết của gà khi bị nhiễm bệnh
khoảng 3-20% nếu không ghép với các bệnh
khác và 21-100% nếu nhiễm kèm với các bệnh
khác gây ra bởi virus, vi khuẩn, ký sinh trùng.
Bệnh Gumboro là một bệnh truyền nhiễm
cấp tính nguy hiểm, gây thiệt hại rất lớn cho
chăn nuôi gà, cả ở quy mô công nghiệp cũng như
quy mô hộ gia đình. Bệnh thường xảy ra ở các
976
Vũ Thị Thu Hằng, Lê Quốc Hòa, Trịnh Thị Bích Ngọc, Vũ Xuân Đăng, Nguyễn Thị Yến,
Nguyễn Văn Tâm, Nguyễn Thị Hoa, Nguyễn Thị Lan, Lê Văn Phan
Năm 1893, Klemperer lần đầu tiên mô tả
hàm lượng chất dinh dưỡng lớn dẫn đến nguy cơ
nhiễm khuẩn trong sản phẩm rất cao nên các
sản phẩm này chủ yếu được bảo quản bằng
Formalin và đây là một nguyên nhân làm giảm
nhanh hiệu giá của kháng thể đặc hiệu, do đó
làm giảm đáng kể thời hạn sử dụng của sản
phẩm, chưa kể đến ảnh hưởng của formalin tồn
dư trong chất lượng sản phẩm thịt sau này. Sản
phẩm nhập khẩu từ Trung Quốc là sản phẩm
tinh chế nhưng có giá thành cao, thời gian nhập
hàng và vận chuyển kéo dài trong khi thời hạn
sử dụng của sản phẩm ngắn gây khó khăn trong
quá trình tiếp cận và sử dụng sản phẩm. Vì vậy,
trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành
nghiên cứu tinh chế kháng thể IgY từ lòng đỏ
trứng gà và ứng dụng để phòng và điều trị bệnh
Gumboro trên gà. Sản phẩm kháng thể tinh chế
được tạo ra kỳ vọng sẽ có giá thành hạ so với
sản phẩm ngoại nhập, đồng thời hạn chế những
nhược điểm của kháng thể lòng đỏ dạng thô.
việc gây miễn dịch cho gà tạo ra kháng thể đặc
hiệu, các kháng thể này được truyền từ huyết
thanh sang trứng. Kháng thể được truyền từ gà
mẹ sang gà con qua giai đoạn tiềm ẩn của trứng
và đóng một vai trò quan trọng trong chức năng
miễn dịch cho gà con (khi hệ miễn dịch chưa
hoàn chỉnh ở giai đoạn đầu) có thể chống lại các
bệnh truyền nhiễm (Rose & Orlans, 1981). Sự
chuyển giao này xảy ra thông qua một thụ thể
trên bề mặt của màng túi noãn hoàng, cho phép
sự vận chuyển có chọn lọc của tất cả các quần
thể IgY có trong máu của gà mẹ (Mohammed &
cs., 1998; Morrison & cs., 2002; Tressler & Roth,
1987). Kháng thể IgY là sản phẩm thu được từ
lòng đỏ trứng của những con gà đã được gây
miễn dịch. Sản phẩm này chứa hàm lượng cao
các kháng thể đặc hiệu và các chất hỗ trợ miễn
dịch sẵn có trong lòng đỏ trứng. Bên cạnh đó,
việc sản xuất IgY từ lòng đỏ trứng để sử dụng
cho gà lại mang đến những ưu việt riêng đối với
hệ miễn dịch. Năng suất sản xuất kháng thể
IgY của 1 con gà 17-35g IgY/gà/năm gấp 5 đến
10 lần so với lượng IgG thu được từ 1 con
thỏ/năm (Schade & cs., 2005), ngoài ra chi phí
cho việc duy trì một đàn gà đẻ trứng thấp hơn
nhiều so với việc duy trì đàn thỏ để có một lượng
kháng thể tương đương. Việc sản xuất kháng
thể đặc hiệu từ lòng đỏ trứng giúp làm giảm các
vi phạm về đạo đức động vật nuôi. Việc sử dụng
kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng để phòng và trị
bệnh cho vật nuôi là một phương án hiệu quả
trong xu hướng chăn nuôi sạch, hạn chế sử dụng
thuốc kháng sinh.
2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu
- Gà mái giống ISA Brown 16 tuần được sử
dụng để gây miễn dịch và thu trứng sản xuất
kháng thể. Gà con 14 ngày tuổi để thực hiện thí
nghiệm đánh giá hiệu quả phòng và trị bệnh
của kháng thể lòng đỏ tinh chế.
- Vacxin 3 trong 1 Nobilis IB multi+G+ND
- Virus IBD cường độc: Chủng IBDV cường
độc được phân lập từ thực địa do Phòng thí
nghiệm trọng điểm Công nghệ Sinh học Thú y
cung cấp. Chủng virus này được vô hoạt với
0,2% Formalin sau đó được phối trộn với chất bổ
trợ MONTANIDETM IMS 1313 VGN trước khi
gây miễn dịch cho gà.
Sử dụng vacxin đúng quy trình là một biện
pháp hiệu quả để ngăn chặn và kiểm soát bệnh
Gumboro trên gà. Bên cạnh đó việc sử dụng
kháng thể lòng đỏ trong quá trình điều trị gà
sau khi mắc bệnh đã cho thấy hiệu quả chữa
bệnh lên đến 90% (số liệu tham khảo điều trị
thực tế). Các sản phẩm IgY trên thị trường Việt
Nam hiện tại có hai nguồn chủ yếu, các sản
phẩm trong nước là các IgY dạng thô, sử dụng
toàn bộ lòng đỏ trứng chưa tách chiết, trong quá
trình tiêm, thường gây ra các vết sưng viêm cho
gà tại vị trí tiêm, ảnh hưởng đến sức khỏe và
chất lượng vật nuôi. Các sản phẩm dạng thô có
- Kit ELISA: IDEXX IBD Ab Test -
Infectious Bursal Disease Virus Antibody Test kit
2.2. Phương pháp
2.2.1. Quy trình gây tối miễn dịch cho gà mái
Tổng số 30 gà hậu bị giống ISA Brown 16
tuần tuổi khỏe mạnh được chia thành 3 nhóm
thí nghiệm. Nhóm 1 (10 con gà) được gây miễn
dịch 3 lần với vacxin 3 trong 1 Nobilis IB
977
Tinh chế kháng thể igy từ lòng đỏ trứng gà và ứng dụng trong phòng và trị bệnh Gumboro trên gà
multi+G+ND, mỗi lần cách nhau 2 tuần. Nhóm
2 (10 con gà) được gây miễn dịch 3 lần với
vacxin và 2 lần với chủng virus cường độc IBD
đã được vô hoạt phối trộn với chất bổ trợ, các lần
gây miễn dịch cách nhau 2 tuần. Nhóm 3 (10
con) là nhóm gà đối chứng không tiêm. Tất cả gà
ở 3 nhóm thí nghiệm được lấy máu và trứng
trước mỗi lần gây miễn dịch. Hàm lượng kháng
thể IBD có trong huyết thanh và trứng của 3
nhóm thí nghiệm được xác định bằng phản ứng
ELISA. So sánh hàm lượng kháng thể IBD có
trong trứng của 3 nhóm thí nghiệm để lựa chọn
quy trình gây miễn dịch cho gà mái.
2.2.4. Đánh giá hiệu quả phòng bệnh và
điều trị bệnh Gumboro của kháng thể IgY
tinh chế
Sử dụng 30 gà 14 ngày tuổi khỏe mạnh,
đồng đều về khối lượng chưa được tiêm phòng
vacxin Gumboro vào thí nghiệm. Gà được chia
thành 3 nhóm thí nghiệm, mỗi nhóm 10 con gà,
nhóm 1 và nhóm 2 không được bổ sung kháng
thể IgY tinh chế, nhóm 3 được tiêm kháng thể
IgY tinh chế với liều 0,5 mL/con, tiêm nhắc lại
lần 2 sau 1 tuần. Sau 7 ngày tiêm kháng thể
mũi 2 ở nhóm 3, cả ba nhóm gà được gây nhiễm
với virus Gumboro cường độc với liều 102
TCID50/con (TCVN, 2011). Sau khi gà thí
nghiệm bắt đầu có biểu hiện lâm sàng của bệnh
Gumboro như giảm ăn, ủ rũ, lông xù, run rẩy
thì tiến hành tiêm kháng thể IgY tinh chế đối
với nhóm 2 với liều 1ml/con, tiêm 2 lần mỗi lần
cách nhau 48 giờ. Theo dõi các biểu hiện lâm
sàng của bệnh Gumboro ở 3 nhóm, đánh giá tỷ
lệ gà ốm, chết ở 3 nhóm gà thí nghiệm.
2.2.2. Xác định hàm lượng kháng thể IBD
bằng phản ứng ELISA
Hàm lượng kháng thể IBD có trong huyết
thanh và trứng của 3 nhóm thí nghiệm được xác
định bằng kit ELISA IBD của hãng IDEXX, thí
nghiệm được tiến hành phản ứng theo hướng
dẫn của nhà sản xuất. Kết quả phản ứng xác
định bằng cách tính tỷ lệ giữa giá trị mẫu kiểm
tra trên giá trị đối chứng dương (S/P).
2.2.5. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng
của nhiệt độ bảo quản đối với kháng thể
IgY tinh chế
Kháng thể tinh chế được bảo quản ở các
nhiệt độ khác nhau: -20°C, 4°C, 37°C. Hàm
lượng kháng thể kháng IBD được xác định ở các
khoảng thời gian bảo quản từ sau 2, 4, 6, 8, 10,
12 tuần đến 12 tháng (ở trong nghiên cứu chỉ
thể hiện kết quả đến 12 tuần) theo phương pháp
ELISA.
Những mẫu huyết thanh có tỷ lệ S/P ≤0,2
(hiệu giá kháng thể ≤ 96) được coi là âm tính, tỷ
lệ S/P >0,2 (hiệu giá kháng thể >396) là dương
tính. Giá trị S/P tỷ lệ thuận với hàm lượng
kháng thể Gumboro.
Hiệu giá kháng thể = 101,09 (log10 S/P) + 3,36
2.2.3. Tinh chế kháng thể IgY
Trứng được làm sạch và sát trùng vỏ trước
khi sử dụng. Quy trình tách chiết được thực hiện
trong phòng sạch đảm bảo vô trùng. Lòng đỏ
trứng được tách cẩn thận từ lòng trắng trứng.
Lòng đỏ sau đó được hòa loãng với nước cất vô
trùng theo tỷ lệ lòng đỏ : nước (1:10). Lòng đỏ
trứng pha loãng được chỉnh pH ở 5,5 sau đó để
qua đêm -20C. Tiếp theo, hỗn hợp lòng đỏ được
rã đông và ly tâm 5.000 vòng/phút trong 30 phút
ở 4C. Sau khi ly tâm, dịch nổi được thu lại,
Amonium sulfate được bổ sung với nồng độ cuối
cùng 29%, 4C và được ly tâm ở điều kiện 8.000
vòng/phút, trong 20 phút, 4C. IgY tinh chế thu
được khi hòa lại tủa sau khi ly tâm với 1xPBS.
Dịch tinh chế IgY được bổ sung chất bảo quản
sau đó chia chai và bảo quản ở 4C.
2.2.6. Ảnh hưởng của chất bảo quản đối với
kháng thể IgY tinh chế
Kháng thể tinh sạch được bổ sung chất bảo
quản ở các nồng độ thường được sử dụng phổ biến,
cụ thể 2,0‰ của formalin và 0,1% của sodium
benzoate sau đó bảo quản ở 4°C. Hàm lượng
kháng thể kháng IBD được xác định ở các khoảng
thời gian bảo quản từ sau 2, 4, 6, 8, 10, 12 tuần
đến 12 tháng (ở trong nghiên cứu chỉ thể hiện kết
quả đến 12 tuần) theo phương pháp ELISA.
2.2.7. Xử lý số liệu
Số liệu thu thập được xử lý phân tích
ANOVA 2 yếu tố bằng phần mềm SAS phiên
978
Vũ Thị Thu Hằng, Lê Quốc Hòa, Trịnh Thị Bích Ngọc, Vũ Xuân Đăng, Nguyễn Thị Yến,
Nguyễn Văn Tâm, Nguyễn Thị Hoa, Nguyễn Thị Lan, Lê Văn Phan
bản 9.1. So sánh các giá trị trung bình giữa các
nghiệm thức ở mức P <0,05 bằng phép kiểm
định Duncan's Multiple range test.
kháng thể Gumboro trong huyết thanh gà sau
khi gây tối miễn dịch đã được đánh giá và được
thể hiện trong bảng 1.
Kết quả so sánh sự biến động kháng thể của
gà mái ở 3 nhóm thí nghiệm (Bảng 1) cho thấy:
Nhóm 1 (gà được tiêm vacxin 3 lần mỗi lần cách
nhau 2 tuần) hàm lượng kháng thể có sự sai
khác có ý nghĩa (P <0,05) mỗi lần tiêm vacxin và
hàm lượng kháng thể tăng dần đạt giá trị cao
nhất tại tuần thứ 8 (giá trị S/P trung bình 2,04
± 0,06), các tuần tiếp theo hàm lượng kháng thể
không tăng thêm. Sự biến động hàm lượng
kháng thể trong nhóm 2 cũng có sự sai khác có ý
nghĩa (P <0,05) qua các lần tiêm cũng tương tự
nhóm 1. Hàm lượng kháng thể tăng dần sau mỗi
lần tiêm, tại thời điểm tuần thứ 10 sau khi tiêm
mũi 2 với kháng nguyên là virus Gumboro
cường độc vô hoạt, hàm lượng kháng thể đạt giá
trị cao nhất (giá trị S/P trung bình 2,84 ± 0,02).
Nhóm 3 đối chứng, sự biến động của hàm lượng
kháng thể sai khác nhau không có ý nghĩa (P
<0,05) trong thời gian theo dõi thí nghiệm. So
sánh hàm lượng kháng thể Gumboro có trong
huyết thanh của 3 nhóm thí nghiệm cho thấy ở
nhóm 2 cho hàm lượng kháng thể trung bình
cao nhất (giá trị S/P trung bình 2,21A). Trong
thời gian miễn dịch, hàm lượng kháng thể tại
thời điểm 8 tuần có hàm lượng kháng thể cao
nhất (giá trị S/P trung bình 2,08A)
3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Đáp ứng miễn dịch của gà trước và sau
khi gây miễn dịch bằng vacxin
Trước khi nghiên cứu quy trình gây tối miễn
dịch cho gà, gà mái giống ISA Brown 16 tuần tuổi
được tiến hành xác định hàm lượng kháng thể
Gumboro có trong huyết thanh bằng phản ứng
ELISA và kết quả được thể hiện trong hình 1.
Hàm lượng kháng thể Gumboro có trong
huyết thanh gà trước khi gây miễn dịch đều đạt
ngưỡng dương tính (với giá trị S/P trung bình
1,302 ± 0,08) không thấy sự khác nhau không có
ý nghĩa ở từng cá thể (với P <0,05) khi phân tích
bằng phần mềm Excel. Gà mái hậu bị có hàm
lượng kháng thể Gumboro trong huyết thanh
cao do trong quá trình chăn nuôi, gà hậu bị được
tiêm phòng vacxin đầy đủ và theo lịch trình để
bảo vệ cho đàn gà trước các tác nhân gây bệnh
truyền nhiễm.
Để thu được kháng thể IgY có hiệu giá cao
trong lòng đỏ trứng gà thì gà mái cần được gây
tối miễn dịch. Trong nghiên cứu này, hai quy
trình gây tối miễn dịch cho gà đã được sử dụng
và kết quả nghiên cứu biến động hàm lượng
Hình 1. Đồ thị mô tả hiệu giá kháng thể Gumboro của gà mái trước khi gây miễn dịch
979
Tinh chế kháng thể igy từ lòng đỏ trứng gà và ứng dụng trong phòng và trị bệnh Gumboro trên gà
Bảng 1. Sự biến động hàm lượng kháng thể Gumboro ở các nhóm thí nghiệm
sau khi gây tối miễn dịch
Thời gian miễn dịch (tuần)
Trung bình
theo nhóm
Nhóm
2
4
6
8
10
12
1
1,29e
1,35e
1,29e
1,31d
1,45d
1,48d
1,32e
1,43c
1,86c
1,9c
2,04b
2,83a
1,36e
2,08a
1,97b
2,84a
1,37e
2,07a
2,03b
2,82a
1,34e
2,06a
1,77b
2,21a
1,34c
2
3
1,36e
1,71b
Trung bình theo thời gian miễn dịch
Ghi chú: Các ký tự a, b, c… là thứ tự sắp xếp từ cao đến thấp theo nhóm giá trị S/P trung bình. Các giá trị trung
bình mang cùng một chữ cái thì không khác biệt có nghĩa thống kê ở mức P <0,05.
Bảng 2. Hàm lượng kháng thể trong trứng của 3 nhóm thí nghiệm theo thời gian
Thời gian miễn dịch (tuần)
Trung bình
Nhóm
theo nhóm
4
6
8
10
12
1
1,22e
1,34d
0,98f
1,21c
1,61c
1,66bc
1,22e
1,51b
1,86b
2,41a
1,15e
1,89a
1,82b
2,55a
1,08f
1,91a
1,83b
2,53a
1,03f
1,89a
1,67B
2,09A
1,09C
2
3
Trung bình theo thời gian miễn dịch
Ghi chú: Các giá trị trung bình mang cùng chữ cái theo sau không khác biệt có ý nghĩa thống kê (P <0,05).
Hình 2. Quy trình tinh chế IgY từ lòng đỏ trứng
Để đánh giá được sự biến động hàm lượng
kháng thể trong trứng ở các nhóm thí nghiệm
khác nhau, trứng gà đã được thu theo từng
nhóm thí nghiệm vào các thời điểm 4, 6, 8, 10 và
12 tuần sau khi gây tối miễn dịch và kết quả
đánh giá phân tích hàm lượng kháng thể bằng
phần mềm SAS được thể hiện trong bảng 2. Kết
quả nghiên cứu cho thấy sự biến động hàm
lượng kháng thể Gumboro trong trứng sai khác
nhau có ý nghĩa thống kê (P <0,05) ở 3 nhóm thí
nghiệm và theo thời gian miễn dịch. Cụ thể,
theo nhóm thí nghiệm, nhóm 2 cho hàm lượng
kháng thể trong trứng cao nhất với giá trị S/P
trung bình theo nhóm = 2,09 (xếp nhóm A), tiếp
đến là nhóm 1 với giá trị S/P trung bình theo
nhóm = 1,67 (xếp nhóm B), nhóm 3 đối chứng có
hàm lượng kháng thể thấp nhất với giá trị S/P
trung bình theo nhóm = 1,09 (xếp nhóm C).
Đánh giá theo thời gian miễn dịch, hàm lượng
kháng thể trong trứng đạt giá trị cao nhất tại
thời điểm 10 tuần sau khi gây tối miễn dịch cho
gà mái với giá trị S/P trung bình theo nhóm =
1,91 (xếp nhóm A) các tuần tiếp theo hàm lượng
kháng thể không có sự biến động.
980
Vũ Thị Thu Hằng, Lê Quốc Hòa, Trịnh Thị Bích Ngọc, Vũ Xuân Đăng, Nguyễn Thị Yến,
Nguyễn Văn Tâm, Nguyễn Thị Hoa, Nguyễn Thị Lan, Lê Văn Phan
Như vậy, với kết quả sự biến động của hàm
lượng kháng thể Gumboro ổn định trong thời gian
theo dõi. Hàm lượng kháng thể Gumboro bảo
quản ở điều kiện 4C thấp hơn so với khi bảo
quản ở điều kiện -20C, tuy nhiên, sự sai khác
này không có ý nghĩ thống kế (p <0,05). Do đó, kết
luận bảo quản kháng thể IgY tinh chế ở điều kiện
4C là phù hợp với các kết quả được công bố
(Schade & cs., 2005). Tương tự như nhiệt độ bảo
quản, chất bảo quản sử dụng trong sản phẩm
kháng thể cũng ảnh hưởng tới tới hiệu giá kháng
thể Gumboro cũng như chất lượng sản phẩm.
Formalin và Sodium benzoate là 2 chất bảo quản
phổ biến có tác dụng kháng khuẩn được lựa chọn
sử dụng trong nghiên cứu. Sản phẩm được bổ
sung chất bảo quản, sau đó theo dõi hiệu giá
kháng thể Gumboro theo thời gian bảo quản ở
4C. Kết quả nghiên cứu cho thấy kháng thể IgY
được bảo quản bằng Formalin có hàm lượng
kháng thể Gumboro giảm dần theo thời gian, sau
12 tuần bảo quản giá trị S/P còn 0,24 ± 0,03.
Trong khi đó, kháng thể IgY tinh chế được bảo
quản bằng Sodium benzoate thì hàm lượng kháng
thể ổn định trong thời gian theo dõi (Hình 5).
Formalin là chất bảo quản có khuyến cáo gây ảnh
hưởng đến sức khỏe sinh vật khi phơi nhiễm ở
nồng độ cao, trong khi đó Sodium benzoate là
chất bảo quản được sử dụng trong thực phẩm, do
đó Sodium benzoate cần được nghiên cứu thêm để
có thể sử dụng trong quá trình sản xuất lâu dài.
lượng kháng thể trong huyết thanh và trong
trứng ở 3 nhóm thí nghiệm, có thể thấy rằng
quy trình gây tối miễn dịch ở nhóm 2 cho hàm
lượng kháng thể trong huyết thanh và trứng cao
nhất so với 2 nhóm còn lại. Thời gian hàm lượng
kháng thể đạt giá trị cao nhất tại tuần 8 sau
gây miễn dịch. Do đó, trong quá trình gây miễn
dịch cho đàn gà cần xác định tuổi của gà mái
trước gây miễn dịch sao cho thời gian đẻ trứng
đều trùng với thời gian mà hàm lượng kháng
thể trong trứng đạt giá trị cao nhất.
3.2. Tinh chế và bảo quản kháng thể IgY
Kết quả tách chiết IgY cho thấy từ một lòng
đỏ có thể tích trung bình khoảng 12 mL, với hiệu
giá IBD (S/P) 2,56 ± 0,111, sau quá trình tách
chiết thu được 40 mL dịch IgY tinh chế có hiệu
giá IBD tương ứng (S/P) 2,60 ± 0,052. Dung dịch
kháng thể IgY sau khi tinh chế có màu trắng
trong. Lòng đỏ trứng ở dạng đặc quánh chứa hàm
lượng lớn các protein, cholesterol, choline, nếu
chưa được pha loãng ở độ pha loãng phù hợp,
kháng thể IgY chưa được giải phóng hoàn toàn,
do đó sau khi tinh sạch, chế phẩm tinh sạch cũng
giúp cơ thể vật nuôi dễ dàng hấp thụ hơn. So
sánh hàm lượng kháng thể trong huyết thanh gà,
trứng và chế phẩm IgY được tách chiết tương ứng
(Hình 3) cho thấy lượng kháng thể IgY trong
trứng và trong chế phẩm tỷ lệ với hàm lượng
kháng thể có trong huyết thanh gà, điều này phù
hợp với nghiên cứu của Klemperer (1893). Như
vậy, trong quá trình khai thác trứng để sản xuất
IgY, cần phải theo dõi định kỳ hàm lượng kháng
thể trong huyết thanh gà để có kế hoạch bổ sung
miễn dịch hợp lý cho đàn gà.
Nhiệt độ trong quá trình bảo quản luôn ảnh
hướng tới hiệu giá kháng thể Gumboro cũng như
chất lượng sản phẩm kháng thể IgY. Để đánh giá
ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu giá kháng thể
Gumboro trong sản phẩm, hiệu giá kháng thể của
sản phẩm IgY tinh chế được theo dõi qua thời
gian ở các điều kiện bảo quản khác nhau (-20C,
4C và 37C). Kết quả thu được (Hình 4) cho thấy
hàm lượng kháng thể Gumboro trong sản phẩm
IgY tinh chế được bảo quản trong điều kiện 37C
giảm nhanh sau 2 tuần (giá trị S/P sau 2 tuần
bảo quản = 0,70 ± 0,18). Trong khi đó, sản phẩm
được bảo quản trong điều kiện -20C và 4C hàm
3.3. Đánh giá hiệu quả phòng và điều trị
bệnh Gumboro của kháng thể IgY tinh chế
Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng
kháng thể Gumboro của các nhóm gà trước khi
tiêm kháng thể đều ở ngưỡng âm tính (giá trị
S/P <0,2). Tại nhóm 3, gà được tiêm kháng thể
IgY tinh chế với liều 0,5 mL/con, nhắc lại sau 1,
hàm lượng kháng thể trong huyết thanh tăng
lên đạt ngưỡng dương tính (giá trị S/P = 1,31 ±
0,02), trong khi đó, ở nhóm 1 và 2 hàm lượng
kháng thể vẫn ở ngưỡng âm tính (Bảng 3). Bảy
ngày sau tiêm kháng thể mũi 2 ở nhóm 3, cả 3
nhóm gà được nhỏ mắt bằng virus Gumboro độc
lực cao phân lập từ thực địa với liều 102 TCID-
50/con. Sau 2 ngày gây nhiễm virus độc lực cao,
gà nhóm 2 được tiêm kháng thể IgY tinh chế với
liều 1 mL/con lặp lại mũi 2 sau 48 h, theo dõi
biểu hiện triệu chứng, bệnh tích và tỷ lệ chết ở
các nhóm thí nghiệm (Bảng 4).
981
Tinh chế kháng thể igy từ lòng đỏ trứng gà và ứng dụng trong phòng và trị bệnh Gumboro trên gà
Hình 3. Mối tương quan hàm lượng kháng thể Gumboro trong huyết thanh gà, lòng đỏ
trứng và chế phẩm IgY sau tinh chế tương ứng của các nhóm gà
Hình 4. Đồ thị mô tả hiệu giá kháng thể của Hình 5. Đồ thị mô tả hiệu giá kháng thể của
sản phẩm được bảo quản ở các nhiệt độ
khác nhau theo thời gian
sản phẩm được bổ sung chất bảo quản khác
nhau theo thời gian
Bảng 3. Giá trị S/P của các nhóm gà trước và sau khi tiêm kháng thể
Nhóm 1
Nhóm 2
Nhóm 3
Trước tiêm kháng thể
0,11 ± 0,04
0,12 ± 0,03
0,12 ± 0,02
0,09 ± 0,05
0,14 ± 0,02
1,31 ± 0,02
Sau tiêm kháng thể cho nhóm 3
Theo kết quả công virus Gumboro cường độc
(Bảng 4) ở nhóm 1 và 2 không được tiêm kháng
thể IgY, tỷ lệ gà ốm cao hơn, lần lượt là 7/10 và
6/10, trong đó có các triệu chứng ỉa chảy, phân
loãng nhiều nước, vàng trắng lẫn lộn, sánh nhớt,
có bọt lổn nhổn là 6/10 con. Nhóm 3 được tiêm
kháng thể, tỷ lệ gà ốm là 2/10, trong đó xuất hiện
các triệu chứng ỉa chảy, phân loãng nhiều nước,
vàng trắng lẫn lộn, sánh nhớt, có bọt lổn nhổn là
1/10 con. Trong những ngày tiếp theo, ở nhóm 1
tỷ lệ gà ốm tăng lên 9/10 con, tỷ lệ gà chết 9/10
con với bệnh tích điển hình của bệnh Gumboro
như xuất huyết cơ đùi, túi Fabricius phía ngoài
thẩm dịch keo nhầy gelatin trong suốt, mặt múi
khế xuất huyết, mủn nát, màu kem đục
(Cheville, 1967; Helmboldt & Garner, 1964)
(Hình 6). Sau 2 ngày công virus độc lực cao,
nhóm 2 được tiêm kháng thể IgY tinh chế, trong
các ngày tiếp theo tỷ lệ gà ốm giảm còn 4/10 con,
tỷ lệ chết 1/10 con với các bệnh tích điển hình của
bệnh Gumboro. Ở nhóm 3 có 1/10 con xuất hiện
các triệu chứng nhưng không có con nào chết
982
Vũ Thị Thu Hằng, Lê Quốc Hòa, Trịnh Thị Bích Ngọc, Vũ Xuân Đăng, Nguyễn Thị Yến,
Nguyễn Văn Tâm, Nguyễn Thị Hoa, Nguyễn Thị Lan, Lê Văn Phan
trong quá trình thí nghiệm. Như vậy kết quả
thời đánh giá phát triển bệnh Gumboro ở nhóm 2
cho thấy kháng thể IgY có khả năng điều trị
bệnh Gumboro, giúp gà nhiễm virus sống sót và
giảm số lượng gà phát bệnh.
phòng bệnh của nhôm 3 cho thấy, tiêm kháng thể
trước khi công virus độc lực cao có khả năng bảo
hộ gà trước tác nhân gây bệnh Gumboro đồng
Bảng 4. Kết quả công virus độc lực cao trên các nhóm gà thí nghiệm
Chỉ tiêu theo dõi
Nhóm 1
Nhóm 2
Nhóm 3
10
Số gà thí nghiệm
10
-
10
-
Lượng kháng thể/con
0,5 mL/con
Liều công cường độc
102 TCID50/con
* Triệu chứng lâm sàng (sau 2 ngày công)
- Gà bỏ ăn, ủ rũ, nằm bệt không vận động
- Ỉa chảy, phân loãng, nhiều nước vàng trắng lẫn lộn, sánh nhớt, có bọt, lổn nhổn
* Điều trị
7/10
6/10
6/10
6/10
2/10
1/10
Lượng kháng thể/con
-
1 mL/con
-
* Triệu chứng lâm sàng
- Gà bỏ ăn, ủ rũ, nằm bệt không vận động
- Ỉa chảy, phân loãng, nhiều nước vàng trắng lẫn lộn, sánh nhớt, có bọt, lổn nhổn
* Bệnh tích
9/10
9/10
4/10
3/10
1/10
0/10
- Xuất huyết cơ ngực và cơ đùi.
9/10
9/10
1/10
1/10
0/10
0/10
- Túi Fabricius phía ngoài thẩm dịch keo nhầy gelatin, trong suốt, mặt múi khế xuất
huyết, mủn nát, màu kem đục
* Tỷ lệ chết
9/10
1/10
0/10
Hình 6. Triệu chứng và bệnh tích của gà thí nghiệm
983
Tinh chế kháng thể igy từ lòng đỏ trứng gà và ứng dụng trong phòng và trị bệnh Gumboro trên gà
đảm bảo duy trì hiệu giá của kháng thể đặc hiệu,
4. THẢO LUẬN
Việc sử dụng IgY tinh sạch từ lòng đỏ trứng
cũng như sự an toàn cho động vật sử dụng thuốc.
Kết quả nghiên cứu cho thấy hiệu quả rõ rệt
trong việc phòng và điều trị bệnh cho gà của IgY
cùng việc sử dụng IgY cho phòng bệnh và giúp gà
phục hồi sau khi bị nhiễm virus, hiệu quả điều
trị trên quy mô lớn hơn của IgY tinh chế cũng đã
được chứng minh trước đây (Malik & cs., 2006;
Mohamed & cs., 2016). Bên cạnh đó, thí nghiệm
gây bệnh thực nghiệm cũng chứng minh sự an
toàn của chế phẩm, không có các đáp ứng phản
vệ do kháng thể có nguồn gốc cùng loài với động
vật được sử dụng. Tuy nhiên đây mới chỉ là
những nghiên cứu bước đầu, cần phải tiến hành
thêm các thí nghiệm để tối ưu quy trình sản xuất
trên quy mô công nghiệp cũng như quy trình sử
dụng tối ưu của chế phẩm.
gà còn mở ra nhiều cơ hội ứng dụng trong việc
điều trị các bệnh khác nhau do khả năng vận
chuyển kháng thể đặc hiệu từ huyết thanh gà
vào lòng đỏ trứng (Mohammed & cs., 1998; Rose
& Orlans, 1981; Tressler & Roth, 1987). Theo
Lanzarini & cs. (2018) tỷ lệ của kháng thể IgY
đặc hiệu chiếm từ 2-10% trong tổng số kháng
thể IgY, như vậy có khả năng thu được kháng
thể đặc hiệu mong muốn với năng suất cao từ
lòng đỏ trứng bằng cách gây miễn dịch cho gà
với kháng nguyên phù hợp. Lượng kháng thể
IgY đặc hiệu trong trứng không phụ thuộc vào
kích thước của trứng mà tỷ lệ thuận với hàm
lượng kháng thể trong huyết thanh (Loeken &
Roth, 1983), vì vậy để thu được hiệu quả miễn
dịch cao nhất cần có quy trình gây miễn dịch tối
ưu, điều này phụ thuộc vào giống gà mái sử
dụng gây miễn dịch, thời gian gây miễn dịch,
kháng nguyên và liều lượng kháng nguyên gây
miễn dịch.
5. KẾT LUẬN
Quy trình gây miễn dịch cho gà mái giống
ISA Brown 16 tuần tuổi bằng vacxin Nobilis IB
multi+G+ND kết hợp với virus Gumboro cường
độc vô hoạt cho đáp ứng miễn dịch cao nhất,
đảm bảo trứng gà có hiệu giá kháng thể cao
phục vụ việc sản xuất kháng thể IgY tinh chế
dùng để phòng và trị bệnh Gumboro trên gà.
Kháng thể IgY tinh chế có hiệu giá cao (ELISA
có giá trị S/P >1,5) có khả năng phòng và điều
trị bệnh Gumboro trên gà.
Trong nghiên cứu này gà mái giống ISA
Brown 16 tuần tuổi đã được lựa chọn và thích
hợp cho quá trình gây tối miễn dịch để đảm bảo
gà có miễn dịch cao khi bước vào thời kỳ thu
hoạch trứng và năng suất thu hoạch trứng được
đảm bảo. Hiệu giá kháng thể trong chế phẩm tỷ
lệ với hàm lượng kháng thể trong huyết thanh,
điều này phù hợp với các nghiên cứu trước đây
(Abd El-Ghany, 2011; Klemperer, 1893). Thời
gian hàm lượng kháng thể đặc hiệu trong huyết
thanh đạt giá trị cao nhất tại tuần 8 sau khi gây
tối miễn dịch, tuy nhiên hàm lượng kháng thể
đặc hiệu trong trứng đạt giá trị cao nhất vào
tuần thứ 10 sau khi gây tối miễn dịch, điều này
có thể do quá trình chuyển kháng thể đặc hiệu
từ huyết thanh sang trứng cần thời gian, kết
quả nghiên cứu này phụ hợp với những công bố
trước đây bởi Patterson & cs. (1962) và Wooley
& Landon (1995). Việc tinh sạch IgY cũng giúp
kéo dài quá trình bảo quản sản phẩm IgY do
loại bỏ được lượng lớn các hợp chất hữu cơ trong
lòng đỏ trứng.
LỜI CẢM ƠN
Nghiên cứu này được thực hiện từ nguồn
kinh phí đề tài “Research and Production of
Antibody (IgY) Product for Prevention and
Treatment of Gumboro, Newcastle and
Infectious Bronchitis (IB) Disease in Chickens”
do dự án Việt Bỉ tài trợ.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Abd El-Ghany W. (2011). Comparison between
immunoglobulins IgY and the vaccine for
prevention of infectious bursal disease in chickens.
Global Veterineria. 6:16-24.
Trong nghiên cứu, việc sử dụng chất bảo
quản Sodium benzoate thay thế cho Formalin
Cheville N.F. (1967). Studies on the pathogenesis of
Gumboro disease in the bursa of Fabricius, spleen,
984
Vũ Thị Thu Hằng, Lê Quốc Hòa, Trịnh Thị Bích Ngọc, Vũ Xuân Đăng, Nguyễn Thị Yến,
Nguyễn Văn Tâm, Nguyễn Thị Hoa, Nguyễn Thị Lan, Lê Văn Phan
and thymus of the chicken. The American journal
of pathology. 51: 527.
human antibodies into the egg yolk of hens.
Immunotechnology. 4: 115-25.
Morrison S.L., Mohammed M.S., Wims L.A., Trinh R.
& Etches R. (2002). Sequences in antibody
molecules important for receptor-mediated transport
into the chicken egg yolk. Mol Immunol. 38: 619-
25. DOI: 10.1016/s0161-5890(01)00095-5.
Helmboldt C.F. & Garner E. (1964). Experimentally
induced Gumboro disease (IBA). Avian Diseases.
8: 561-575.
Klemperer F. (1893). Ueber natürliche Immunität und
ihre Verwertung für die Immunisierungstherapie.
Arch Exp Pathol Pharmakol. 31: 356-382.
Patterson R., Youngner J.S., Weigle W.O. & Dixon F.J.
(1962). Antibody production and transfer to egg
yolk in chickens. J Immunol. 89: 272-8.
Lanzarini N.M., Bentes G.A., Volotão E.d.M. & Pinto
M.A. (2018). Use of chicken immunoglobulin Y in
general virology. Journal of Immunoassay and
Rose M.E. & Orlans E. (1981). Immunoglobulins in the
egg, embryo and young chick. Dev Comp
Immunol. 5: 15-20. DOI: 10.1016/s0145-
305x(81)80003-1.
Immunochemistry.
39:
235-248.
DOI:
10.1080/15321819.2018.1500375.
Loeken M.R. & Roth T.F. (1983). Analysis of maternal
IgG subpopulations which are transported into the
chicken oocyte. Immunology. 49: 21-8.
Schade R., Calzado E.G., Sarmiento R., Chacana P.A.,
Porankiewicz-Asplund J. & Terzolo H.R. (2005).
Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): A
review of progress in production and use in
research and human and veterinary medicine.
Alternatives to Laboratory Animals. 33: 129-154.
Malik M.W., Ayub N. & Qureshi I.Z. (2006). Passive
immunization using purified IgYs against
infectious bursal disease of chickens in Pakistan.
Journal of veterinary science. 7: 43-46. DOI:
10.4142/jvs.2006.7.1.43.
TCVN (2011). TCVN 8669-6:2011 Quy trình kiểm
nghiệm vacxin
nhược độc.
-
Phần 6: Vacxin gumboro
Mohamed M., Maary K., Dawoud T., Mubarak A.,
Hessain A. & Mohamed K. (2016). Production and
Evaluation of the Immuno-protective Efficacy of
the Immunoglobulins IgY-antibodies Prepared
Against Infectious Bursal Disease. International
Journal of Pharmacology. 12: 749-753. DOI:
10.3923/ijp.2016.749.753.
Tressler R.L. & Roth T.F. (1987). IgG receptors on the
embryonic chick yolk sac. J Biol Chem. 262:
15406-12.
Woolley J.A. & Landon J. (1995). Comparison of
antibody production to human interleukin-6 (IL-6)
by sheep and chickens. Journal of Immunological
Methods. 178: 253-265. DOI: 10.1016/0022-
1759(94)00263-V
Mohammed S.M., Morrison S., Wims L., Trinh K.R.,
Wildeman A.G., Bonselaar J. & Etches R.J.
(1998). Deposition of genetically engineered
985
10 trang
09/01/2024
560
Bạn đang xem tài liệu "Tinh chế kháng thể IGY từ lòng đỏ trứng gà và ứng dụng trong phòng và trị bệnh Gumboro trên gà", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên
File đính kèm:
- tinh_che_khang_the_igy_tu_long_do_trung_ga_va_ung_dung_trong.pdf
